抗SUMO抗体在多种自身免疫性疾病中的初步研究

摘要

目的:　　本研究通过构建质粒特异性的表达类泛素化修饰物(Small ubiquitin-related modifiers，SUMO)，并初步研究SUMO蛋白在原发性胆汁性胆管炎(Primary biliary cholangitis，PBC)，系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)，类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)，干燥综合征(Sjogren syndrome，SS)多种典型性自身免疫性疾病患者血清中的表达水平，探究抗SUMO抗体是否可作为PBC的特异性血清标志物。并结合患者临床病历资料，探究SUMO与可溶性酸性磷酸化核蛋白(Acid soluble phosphorylated nuclear protein，Sp100)间的内在联系及对患者肝功能的影响。　　方法:　　1.利用PCR和ET克隆技术制备含有SUMO1，SUMO2，SUMO3片段的质粒，将其分别导入大肠杆菌进行蛋白的诱导和表达，最后进行蛋白的纯化。　　2.采用斑点印迹法初步筛查原发性胆汁性胆管炎(PBC)患者血清样本中的SUMO阳性标本，并用Western blot进行验证，获取阳性参考血清。通过实验条件的不断改善，建立最适的抗SUMO抗体ELISA诊断体系。　　3.通过建立的ELISA诊断体系，分别检测抗SUMO抗体3种亚型在PBC，SLE，SS及RA中的阳性率，并通过卡方检验分析其差异性。斑点印迹法和Western blot验证ELISA诊断体系的有效性。　　4.结合患者临床病历资料，采用t检验对患者的各类生化指标进行统计学分析，发现抗SUMO抗体阳性患者病症上的共性，利于后期研究其致病机制，为其提供针对性的治疗提供依据。　　结果:　　1.与其他非PBC自身免疫性疾病和健康对照相比，抗SUMO1抗体，抗SUMO2抗体，抗SUMO3抗体在PBC中的阳性检出率高(P＜0.01)。　　2.抗SUMO抗体标记物在PBC中的特异性高达99％，其敏感性保持在86％左右。　　3.抗SUMO抗体在其他自身免疫性疾病人群中的阳性率无明显差异(P＞0.05)。　　4.在抗Sp100抗体阳性与阴性的PBC样本中，抗Sp100抗体阳性组中抗SUMO抗体的阳性率显著高于抗Sp100抗体阴性组（P＜0.05），其总胆红素均值和直接胆红素均值较抗SUMO抗体阴性组明显增高(P＜0.05)。　　5.抗SUMO抗体阳性组的非PBC自身免疫性疾病中的胆红素均值较抗SUMO抗体阴性组高。　　结论:　　高特异性抗SUMO抗体有望成为PBC诊断的一种新型抗体，对于提高PBC的临床诊断效率意义重大。SUMO蛋白与Sp100联系紧密，其对患者的肝功能具有潜在性的影响。

目录

摘要

英文缩写

图表清单

第一章 绪论

1．1 SUM0蛋白的定义、分类及结构

1．2 SUMO化修饰途径

1．2．1 SUMO的成熟

1．2．2 SUMO与E1的偶联

1．2．3 SUMO与E2的偶联

1．2．4 SUMO与E3的偶联

1．3 SUMO化修饰的底物特点

1．4 SUMO表达系统的优势

1．5 SUMO化修饰与疾病

1．5．1 肿瘤

1．5．2 阿尔兹海默症

1．5．3 亨廷顿舞蹈症

1．6 问题与展望

1．7 本研究的目的、内容、意义、实验方案的设计及其可行性研究

1．7．3 实验方案设计

1．7．4 可行性研究

2．1 实验材料

2．1．1 实验对象

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器和耗材

2．1．4 主要溶液配方

2．2 实验方法

2．2．1 SUM01、SUM02、SUM03三种蛋白表达质粒的构建

2．2．2 SUM01、SUM02、SUM03三种蛋白的诱导与纯化

2．2．3 目的蛋白表达的检测

2．2．4 目的蛋白的大量表达和纯化

2．2．5 目的蛋白超滤

2．2．6 采用斑点印迹法初步筛查PBC患者血清样本中的SUMO阳性标本

2．2．7 Western blot验证斑点印迹法筛选出的SUMO阳性样品，获取阳性参考血清

2．2．8 抗SUMO抗体ELISA诊断体系的建立

2．2．9 抗SUMO抗体在其他自身免疫性疾病中的检测

2．2．1 1统计学分析

第三章 实验结果

3．1 SUM0三种蛋白亚型的纯化结果

3．2 构建抗SUMO抗体ELISA的诊断体系

3．2．1 获取抗SUMO抗体阳性样本

3．2．2 ELISA抗原包被量的筛选

3．2．3 ELISA抗体滴度(一抗)的筛选

3．2．4 ELISA体系中其他条件的优化

3．2．5 ELISA诊断效率的评价

3．3 ELISA检验PBC和其他自身免疫性疾病血清样本

3．4 Western blot和斑点印迹法验证SLE、SS及RA疾病中抗SUMO抗体阳性标本

3．5 PBC和其他自身免疫性疾病的抗SUMO抗体阳性率比较

3．6 其他自身免疫性疾病中的抗SUMO抗体阳性率表达

3．7 PBC患者的抗SUMO抗体在抗Sp100抗体分组间的阳性率比较

3．8 735例自身免疫性疾病患者的病历资料分析

3．8．1 319例PBC患者的生化指标分析

3．8．2 465例其他自身免疫性疾病患者的生化指标分析

第四章 讨论与展望

第五章 本研究的不足

参考文献

综述

致谢

攻读硕士期间发表的论文及专著

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