引物和探针核苷酸错配对PCR灵敏度和特异性影响的研究

摘要

PCR（Polymerase chain Reaction，聚合酶链式反应）是分子生物学中一种重要的诊断技术，灵敏度与特异性是表现其扩增效率的两个重要参考指标。影响PCR扩增效率的因素众多，而引物和探针的设计是一个PCR成功的关键。目前有关引物设计的研究多集中于引物的长度、GC含量等方面，而引物与模板的错误结合而引起的非特异性扩增或扩增效率下降的相关研究还很匮乏且不系统，并且无适用于临床应用的实例，目前还没有探针核苷酸错配对PCR检测影响的相关研究。为了提高PCR设计的效率和可信度，从引物与探针的核苷酸序列的特异性对扩增效率的影响进行研究十分必要，为引物与探针的设计提供更可靠的参考。　　在本论文的第二章中，我们以肺炎衣原体的全核酸为模板，在上下游引物的不同位点引入核苷酸错配，研究单个核苷酸错配、多个核苷酸错配在不同位点、数量以及错配类型对扩增效率的影响，并囊括了引物3'端4种碱基突变为其它任何碱基类型对扩增效率的影响;同时考虑到DNA聚合酶的影响，在经过对市场上商业化DNA聚合酶扩增效率的对比后，研究扩增效率较好的Takara和Platinum两种DNA聚合酶在引物发生核苷酸错配时对反应扩增效率的影响情况，本实验对扩增效率的界定是通过实时荧光定量PCR定量的拷贝数进行计算获得的。进一步研究，通过对FRET探针核苷酸进行错配，在FAM探针上的不同位点依次增加核苷酸错配的数量，研究其对PCR检测的核苷酸错配的容忍度。在第三章中，将错配研究所得到的结论应用于实际引物设计，对临床上18S rRNA序列同源性较高的巴贝斯虫以及泰勒虫进行分子区分，设计特异性地扩增巴贝斯虫的PCR，并且通过临床样品和其它参考方法比较，并用电泳和测序验证。　　上下游引物进行核苷酸错配时，其结果表明，单个核苷酸错配:Platinum DNA聚合酶比Takara DNA聚合酶的扩增效率更低，单个核苷酸错配对Takara DNA聚合酶的扩增效率没有太大影响（接近100％）;引物3'端核苷酸由C变为A，以及由G变为C时扩增效率最差，由T变为C以及由A变为C时，扩增效率最好;距离3'端4个碱基位置发生错配时，扩增效率为82.3％;Platinum DNA聚合酶在引物3'端使用简并碱基，简并两个，三个，四个碱基的平均扩增效率分别为59.3％、43％、33.9％。多个核苷酸错配时:Platinum DNA聚合酶和Takara DNA聚合酶在引物5'端及引物中间的错配的平均扩增效率为92.6％和100％，对扩增效率影响不明显，5'端能够容忍连续8个核苷酸错配;Takara DNA聚合酶在引物3'端连续4个错配时扩增效率下降最快（15％以下）;上下游引物错配位点不在3'端时，其总数加起来为10个时，扩增效率不低于40％。　　FAM探针进行核苷酸错配时，其结果表明:探针发生少数几个错配时，扩增效率没有影响，但在探针中间位置连续发生5个错配时，将直接导致没有扩增曲线;在任何位点发生错配时，其Tm值会随着错配个数的增加而逐渐下降，且错配位点发生在探针的中间时，其Tm值下降的更明显:发生4个核苷酸错配时，中间位点的Tm值下降10℃，下降幅度明显大于探针3'端与5'端错配4个时Tm下降的3℃。　　巴贝斯虫和泰勒虫是以蜱虫为传播媒介、胞内寄生的原虫，它们的18S rRNA序列高度相似，临床症状极度相近，实际检测中难以区分。本研究的文献查阅和初步试验表明，被大家最广泛认可的PCR方法不可以区分这二种病原体。本研究应用错配结论进行引物设计，建立区分巴贝斯虫与泰勒虫的PCR方法。在使用设计的巴贝斯虫特异性引物扩增人工构建的泰勒虫18S rRNA质粒时，当特异性引物与泰勒虫只差引物3'端最后一个核苷酸且模板浓度为100拷贝/反应时，若引物由G变为C，两种聚合酶都没有扩增出泰勒虫产物;由T变为G时，Takara DNA聚合酶扩增出泰勒虫产物，Platinum DNA聚合酶没有扩增出泰勒虫产物;由A变为C时，两种聚合酶都能扩增出泰勒虫产物。使用由G变为C这套特异性引物扩增40个来源不同的临床样品时，结果显示阳性率为7.5‰测序结果表明扩增序列正确，低于引用的常用的引物的50％与30％，且其测序结果中有泰勒虫序列出现。　　综上所述，本研究关于引物与探针核苷酸错配对扩增效率的影响表明，在引物3'端发生核苷酸错配时，不同DNA聚合酶的效率有差别，Platinum DNA聚合酶比Takara DNA聚合酶的特异性更强，而Takara DNA聚合酶的灵敏度更高，能够容忍较多的错配;引物3'端由G变为C和由T变为G时对PCR扩增效率影响最大;错配发生在距离3'端4个碱基或发生在5'端（能容忍连续8个错配）和中间时，对扩增效率的影响不大;上下游引物除3'端以外的其它位点错配在错配数量达到10个时仍然能有扩增反应。探针核苷酸在中间发生错配时对扩增效率的影响较大，能容忍的错配个数为5个核苷酸。本研究关于引物设计的实际应用表明:基于上述结论所建立的PCR方法可特异性地区分诊断巴贝斯虫和泰勒虫，这将为在临床情况下区分诊断类似于像巴贝斯虫与泰勒虫这种基因同源性较高的病原体提供了重要的参考依据。但关于错配延伸的相关机制目前尚不明确，对其进行更深入的研究将为引物和探针的设计提供更多的参考价值。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 PCR的原理与应用

1．2 影响PCR扩增效率的因素

1．3 DNA聚合酶

2 PCR引物与探针设计

3 巴贝斯虫与泰勒虫核酸的分子检测

3．1 分类

3．2 分子诊断方法

第二章 引物和探针核苷酸错配对PCR灵敏度与特异性影响的研究

1 材料

1．1 肺炎衣原体

1．2 试剂

1．3 仪器

2 方法

2．1 肺炎衣原体高效扩增系统的确定

2．2 七种商业化DNA聚合酶扩增效率的比较

2．3 PicoGreen法确定衣原体模板的拷贝数

2．4 引物核苷酸错配的设计

2．5 兼并引物的设计

2．6 探针错配的设计

3 结果

3．1 高效扩增系统的建立

3．2 不同商业化DNA聚合酶扩增效率的比较

3．3 引物3’端单核苷酸错配对PCR扩增效率的影响

3．4 在不同位点的多个核苷酸错配对PCR扩增效率的影响

3．5 核苷酸错配在上下游引物不同位点对PCR扩增效率的影响

3．6 核苷酸错配对探针检测的影响

4 讨论

第三章 区别诊断巴贝斯虫和泰勒虫的PCR方法的建立

1 材料

1．1 质粒及临床样品

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 质粒构建

2．2 引物设计

2．3 PCR以及琼脂糖凝胶电泳分析

2．4 参考引物与设计引物扩增临床样品

3 结果

3．1 质粒验证聚合酶与错配类型的结果

3．2 引物扩增临床样品的比较结果

4 讨论

参考文献

全文总结

致谢

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