弯曲菌在患病畜禽体内组织分布特征及分离株分子流行病学分析

摘要

弯曲菌（Campylobacter）是一种重要的人兽共患食源性病原菌，可以引起人类细菌性胃肠炎以及一系列的并发症。其中格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)是最为严重的并发症，而且特定血清型空肠弯曲菌引起的肠炎被认为是重要的前驱因子。弯曲菌广泛存在于许多温血动物的肠道和自然界中，畜禽是弯曲菌重要的贮存宿主，感染动物通常无明显病症，呈隐性带菌状态，但可持续向外界排菌，通过排泄物或分娩污染食物和饮水，进而引起人类以及其他动物感染。因此，控制或消减畜禽源弯曲菌，减少人们暴露于这种病原菌的风险是预防和控制弯曲菌病的重要前提。本文研究的主要目的是:(1)较为系统地调查与分析家禽和家畜中弯曲菌的流行现状与特点以及患病畜禽体内脏器及肠道等组织感染分布情况;(2)应用MLST分子分型技术对畜禽源不同组织弯曲菌分离株进行分子亚分型研究，以期探明宿主间、宿主体内不同组织弯曲菌分布特征、种群结构，揭示不同宿主间、同一宿主体内不同组织弯曲菌的遗传关系以及可能的传播规律，为有效防控弯曲菌病提供数据支撑。　　1弯曲菌在患病畜禽体内组织分布特征的调查与分析　　自2016年10月至2017年9月，于扬州市某动物医院畜禽门诊采集送检畜禽病料835例并详细记录病例信息如畜禽不同种类、临诊是否患有不同疾病、有无腹泻症状等。其中家禽796例，共5885份样品，包括鸡475例、鸭78例、鹅235例。家畜病例39例，共275份样品。以国标方法作对照，应用本实验室已建立的多重PCR方法，对上述病例不同组织进行空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离和鉴定。　　家禽检测结果显示，不同种类家禽弯曲菌感染率悬殊较大，阳性率从48.72％到72.00％，鸡、鸭、鹅阳性率分别为72.00％、48.72％、52.34％，鸡弯曲菌感染阳性率极显著高于鸭、鹅(P＜0.01)，结果表明，患病家禽中，鸡最为易感，其次是鹅。另外，送检家畜39例，弯曲菌阳性18例，平均阳性率为46.15％，其中，送检猪33例，17例呈结肠弯曲菌阳性，阳性率为51.52％。　　对畜禽体内不同部位进行检测，结果显示，在鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、盲肠内容物、肛拭样和胆囊均有空肠弯曲菌和结肠弯曲菌检出，同时检出的检出率分别为0.52％、2.32％、0.44％、0.85％、0.63％、3.17％、5.07％、0.30％。在鸭脾脏、肺脏、肾脏、盲肠内容物、肛拭样和胆囊部位检出空肠弯曲菌，心脏和肝脏未检出，结肠弯曲菌在肺脏、盲肠内容物、肛拭样样品中检出，而且在这三个部位同时检出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌，检出率分别为2.67％、4.11％、1.33％。在在鹅心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、盲肠内容物、肛拭样和胆囊部位均检出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌，仅在肾脏和盲肠盲肠内容物同时检出，检出率分别为0.43％和2.99％。在猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、盲肠内容物、肛拭样和胆囊部位检出结肠弯曲菌，分离率分别为:7.14％、9.09％、6.45％、6.45％、9.68％、36.67％、41.94％和5.88％。结果表明，畜禽不同分离部位弯曲菌检出结果不同，在家禽尤其在鸡各个分离部位均同时检出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌，但检出率均不高。另外发现，鸡胆囊弯曲菌检出率较高于鸭和鹅。　　对阳性家禽个体体内弯曲菌检出情况进行统计，1-6个分离部位有弯曲菌检出的家禽占比存在显著性差异（P＜0.05），而且约有87.77％的家禽在1-3个分离部位检出弯曲菌，仅少数家禽在4-6个分离部位检出弯曲菌，占阳性家禽的12.23％。研究也发现，在呈弯曲菌阳性的319例家禽中，仅脏器呈弯曲菌阳性的病例有22例，占比6.90％，肠道和脏器均呈阳性的家禽有102例，占比31.97％，仅肠道呈阳性的病例有195例，占比61.13％，仅脏器呈弯曲菌阳性的家禽占比极显著低于肠道呈弯曲菌阳性的家禽(P＜0.01)，而且肠道和脏器均呈弯曲菌阳性的家禽占比显著低于仅肠道呈弯曲菌阳性的家禽(P＜0.05)。在肠道有检出297例家禽中，各个脏器组织均有不同程度弯曲菌检出，其中肺脏弯曲菌检出率最高，为17.17％，其次是肾脏、脾脏、心脏和肝脏，检出率分别为16.16％、11.11％、9.43％和8.75％。肺脏弯曲菌检出率极显著高于心脏和肝脏(P＜0.01)，显著高于脾脏(P＜0.05)。结果表明，弯曲菌更易定植于家禽的肠道，也可引起肠道外感染，在被侵袭的脏器组织中，更易侵袭家禽的肺脏或肾脏，其次是脾脏或肝脏。　　根据有无腹泻症状对畜禽进行分类，检测结果显示，临床表现腹泻症状的鸡弯曲菌检出率极显著高于无腹泻症状的鸡(P＜0.01)，临床表现腹泻症状的鹅弯曲菌检出率显著高于无腹泻症状的鹅（P＜0.05）以及临床表现腹泻症状的猪弯曲菌检出率极显著高于无腹泻症状的猪(P＜0.01)猪，以上结果可以发现，有腹泻症状的畜禽弯曲菌检出率显著高于无腹泻症状的畜禽(P＜0.05)，说明弯曲菌可能和畜禽腹泻有关。对临诊不同疾病情况下家禽弯曲菌检出情况进行统计，寄生虫组和病毒组弯曲菌检出率显著高于细菌组(P＜0.05)。另外猪检测结果显示，不同组别间弯曲菌检出率没有显著性差异(P＞0.05)，但可以发现寄生虫组弯曲菌检出率高达58.82％(10/17)。以上结果表明，在不同疾病情况下，畜禽有着较高的检出率，尤其在患有病毒病以及寄生虫感染的畜禽，而患有细菌病的畜禽检出率较低，可能与细菌之间的竞争排斥有关。　　2基于MLST的不同组织弯曲菌分离株流行特征分析　　本研究选取aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt和uncA7对管家基因，对232株不同动物源弯曲菌及不同组织分离株进行MLST分型研究。MLST分型结果显示:232株分离株被分为112种不同的序列型，分属12种同源复合体和独特型，其中105株空肠弯曲菌被分为66种ST型，分属10种同源复合体和独特型，127株结肠弯曲菌，被分为46种ST型，分属2种主要的同源复合体和独特型。有86株细菌属于60个新序列型，属于新序列型分离株占弯曲菌总分离株的37.07％，其中空肠弯曲菌54株，包含鸡源肝脏、脾脏、胆汁以及盲肠内容物和肛拭样分离株各12、1、7、3、10株，包含鸭胆汁以及盲肠内容物和肛拭样分离株各1、3、2株，包含鹅心脏、肝脏、脾脏、肺脏以及盲肠内容物和肛拭样分离株各1、2、2、1、6、3株;结肠弯曲菌32株，包含鸡心脏、肝脏、以及盲肠内容物和肛拭样分离株各1、7、13、4株，鸭盲肠内容物分离株2株以及鹅肝脏、肾脏、胆汁和肛拭样分离株以及猪肛拭样分离株均分别有1株出现新序列型。　　鸡源、鸭源、鹅源、鸽源、猪源弯曲菌分别分属9、3、7、1、1种同源复合体和独特型，不同来源的菌株同源复合体具有一致性，含两种及两种以上来源菌株的同源复合体有7种，其中含两种来源菌株的同源复合体居多，其中有6种均含有鹅源分离株，5种均含有鸡源分离株，3种均含有鸭源分离株。本研究所有弯曲菌分离株MLST分型结果所获得序列型112种，有10种已知的序列型含有两种或两种以上不同来源的弯曲菌分离株，共包含分离株62株。其中序列型ST-828包含了三种不同来源的分离株，其余9种序列型均含有两种不同来源的弯曲菌分离株，而且大多数包含鸡源和鹅源两种来源弯曲菌分离株。对多个组织检出畜禽个体弯曲菌分离株MLST分型结果显示:同一畜禽体内不同组织分离株有相同的序列型，如170413J5、170504E2和17031622个体不同组织序列型分别为ST-860、ST-825、ST-828，较少个体含有2-3种序列型。结果表明，各组织弯曲菌亲缘关系较近，而且同一个体可感染多种型别的弯曲菌。　　对扬州市及周边地区弯曲菌分离株以及结合PubMLST数据库发现，我国扬州及扬州周沩地区部分分离株和国际菌株基因种群结构相同，另外也发现部分序列型目前仅在中国被发现，如序列型ST-6077、ST-4259、ST-4265、ST-4268、ST-4324、ST-6521、ST-6914、ST-7268、ST-7469和ST-8089等，结果表明我国部分菌株与国际菌株之间之间遗传关系较为密切，而且也可以说明弯曲菌的分布还具有地域性特征。　　PubMLST数据库显示，序列型ST-131与弯曲菌肠胃炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome，GBS)以及Fisher综合症等散发病例有关，本研究在鸡源弯曲菌分离株发现。临诊不同疾病家禽分离株MLST分型结果表明，这部分分离株序列型呈现复杂性和多样性，如寄生虫感染病例分离株所获得序列型种类多样，高达19种，还有部分序列型特定存在某一疾病病例的分离株中，如序列型ST-872在新城疫及马立克氏病病例分离株中均有分布，总的来说不同疾病情况下家禽弯曲菌分离株序列型和疾病之间没有明显对应的关系。　　不同动物源及其不同组织弯曲菌遗传关系分析显示:不同畜禽宿主之间以及宿主体内不同脏器和肠道组织分离株序列型均呈一定的交叉分布，表明不同种家禽之间以及畜禽之间可能存在相同的传染源，脏器组织和肠道组织也可能存在相同的传染源，肠道感染是脏器感染的潜在因素。

目录

摘要

符号说明

综述 弯曲菌和弯曲菌病研究进展

1 病原学

2 感染宿主范围

3 弯曲菌流行现状

3．1 人弯曲菌病流行现状

3．2 动物源弯曲菌流行现状

4 弯曲菌病

4．1 人弯曲菌病

4．2 弯曲菌和动物疾病

5 预防和控制

6 弯曲菌分子分型技术研究进展

7 展望

第一章 弯曲菌在患病畜禽体内组织分布特征的调查与分析

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2．1 患病畜禽弯曲菌检测结果

2．2 患病畜禽弯曲菌流行病学分析

2．3 弯曲菌在患病畜禽体内组织感染分布特征分析

3 讨论

参考文献

第二章 基于MLST的不同组织弯曲菌分离株流行特征分析

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2．1 新序列型

2．2 不同组织弯曲菌所属不同序列型和同源复合体的数量

2．3 不同组织弯曲菌各管家基因各等位基因值的数量

2．4 不同同源复合体中各个来源弯菌分离株分布情况

2．5 不同同源复合体脏器组织和肠道组织弯曲菌分离株分布情况

2．6 多个组织检出畜禽个体弯曲菌分离株MLST分型结果

2．7 禽源及猪源分离株序列型在其各组织分布情况

2．8 禽源弯曲菌分离株序列型在各个来源地分布情况

2．9 临诊不同症状及不同疾病情况下畜禽源分离株MLST分型分析

2．10 国内外弯曲菌分离株MLST分型情况比较分析

3 讨论

参考文献

附录

致谢

声明