急性T淋巴细胞白血病中LMO2基因重排的研究

摘要

目的:　　1.检测264例初诊急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）患者LMO2基因重排的发生率，同时检测重排阳性组和阴性组患者LMO2等9种原癌基因mRNA的表达水平，明确LMO2基因重排与其表达水平是否有相关性。另外，对部分患者进行NOTCH1等多种基因突变检测及芯片-比较基因组杂交（array-CGH），明确LMO2基因重排和其他基因突变、DNA拷贝数变化之间的关联性。　　2.应用全基因组测序（WGS）技术检测2例LMO2基因重排阳性T-ALL患者的对手基因，并阐明致病机制。　　方法:　　1.收集264例初诊T-ALL患者的骨髓细胞，应用短期培养法制备染色体悬液，采用 R显带进行核型分析。采用荧光原位杂交（FISH）技术和实时荧光定量聚合酶链反应（RQ-PCR）技术分别检测264例T-ALL患者LMO2基因重排发生情况和49例 T-ALL患者 LMO2等9种原癌基因 mRNA表达水平。利用 DNA抽提试剂盒（Invitrogen公司生产）抽提基因组DNA，应用PCR扩增基因组DNA，同时采用PCR产物双向测序的方法分析88例T-ALL患者NOTCH1等疾病相关基因突变情况。对22例有足量DNA样本的T-ALL患者，应用芯片-比较基因组杂交技术（array-CGH）检测 DNA拷贝数变化。最终，综合分析 LMO2基因重排、表达、基因突变、DNA拷贝数变化之间的关联性。　　2.收集2例LMO2基因重排阳性的T-ALL患者冻存的骨髓细胞，应用DNA抽提试剂盒（Invitrogen公司生产）抽提基因组DNA，送检至少4μgDNA于上海伯豪生物技术有限公司进行全基因组测序。通过该检测公司对测序结果进行深入分析，明确2例T-ALL患者LMO2基因的对手基因，并分析其参与致病机制。　　结果:　　1.264例T-ALL患者中LMO2基因重排、基因表达、基因突变和array-CGH变化等情况　　264例初诊T-ALL患者经FISH技术检测，发现LMO2基因重排阳性的有24例，阳性率为9.1％，其中男性21例，女性3例。12例病人通过核型分析发现有累及人类染色体11p12-13的异常，包括10例病人核型结果为常见的t(11;14)(p13;q11)（10/264，3.8%），2例病人核型结果为del(11p12)。本组T-ALL患者中，LMO2基因隐匿性重排比率为4.5%（12/264）。LMO2基因重排阳性组与阴性组患者相比较，年龄更小（<18岁）、血红蛋白值、乳酸脱氢酶值、异常核型比例更高（P值均<0.05），而在不同的性别、骨髓原始细胞比例、外周血白细胞及血小板水平方面，均无统计学差异（P值均>0.05）。　　对于上述的24例LMO2基因重排阳性的T-ALL患者，我们同时应用由BAC克隆 RP11-242H9（标记红色荧光素）和 RP11-256C2（标记绿色荧光素）制备而成的TCRA/D基因的探针行FISH检查，结果发现，10例T-ALL患者核型结果中包含t(11;14)(p13;q11)，核型分析和 FISH验证基本一致，另外有4例 T-ALL患者也同时检测出LMO2和TCRA-TCRD基因重排，提示隐匿性的t(11;14)(p13;q11)。24例LMO2基因重排阳性的T-ALL患者中，有14例（58.33%）患者明确为染色体易位 t(11;14)(p13;q11)，包含10例核型已经发现的t(11;14)(p13;q11)和4例隐匿性的LMO2和TCRA-TCRD基因重排。　　我们通过全基因组测序方法发现一例T-ALL患者同时存在LMO2和TCRB基因重排，这一发现促使我们在上述24例LMO2基因重排阳性的T-ALL患者中进行TCRB基因重排的筛查。我们应用BAC克隆RP11-1084E14和RP11-114L10制备的FISH探针行进一步检查，发现2例T-ALL患者存在TCRB基因重排，包含上述的通过全基因组测序发现的t（7;11）（q35;p13）,还有1例 T-ALL患者也同时检测出 LMO2和TCRB基因重排。而该患者也检测出了TCRA-TCRD基因重排，结合该患者的核型结果中包含t(8;14)(q24;q11)，我们推测TCRA-TCRD基因重排并不是与LMO2基因断裂融合而成的，而是与位于8q24的MYC基因发生了融合，我们应用了BAC克隆RP11-440N18制备的FISH探针进行验证。结果与我们推测的一致，TCRA-TCRD基因与MYC基因发生了融合，而LMO2和TCRB基因发生了融合。　　我们选取了49例（10例患者LMO2基因重排阳性，39例患者LMO2基因重排阴性）有足量冻存细胞的T-ALL患者样本，提取了足量的总RNA，逆转成cDNA后进行LMO2、TAL1、LYL1、STAG2、SEPT1、TLX1、TLX3、LEF1、MEF2C(44例患者行MEF2C检测)等9个T-ALL相关的癌基因的表达水平的检测。结果发现，LMO2基因重排阳性组患者和阴性组患者相比较，LMO2（P=0.02）、LEF1（P=0.015）基因表达水平较高，而MEF2C（P=0.04）基因表达水平较低，其余6个基因表达水平没有统计学差异（P>0.05）。　　对于264例进行LMO2基因重排检测的T-ALL患者，我们选取了88例有足量冻存细胞的患者样本，提取了基因组 DNA，进行 LMO2、FBXW7、IL7R、NOTCH1、PHF6、WT1等基因突变检测。88例患者中，13例患者LMO2基因重排阳性，75例患者基因重排阴性。通过检测，我们发现43例病人（48.9%）没有检测到突变，25例病人（28.4%）存在一个基因突变，20例病人（22.8%）有一个以上基因突变。FBXW7、IL7R、NOTCH1、PHF6、WT1基因突变分别在8/88(9.1%)、4/88(4.5%)、40/88(45.5%)、12/88(13.7%)和4/88(4.5%)的T-ALL患者中发现。其中，8例T-ALL患者中2例患者FBXW7基因突变单独发生，另外6例同时存在NOTCH1基因HD区域基因突变。4例T-ALL患者检测出IL7R基因6号外显子的突变，该突变导致IL7R蛋白跨膜区域的氨基酸残端P240–S246的插入或者置换。NOTCH1基因突变在40例患者中检测到：62.5%患者HD区域发生基因突变，25.0%患者PEST区域发生基因突变，7.5%患者基因突变发生区域在HD和PEST共同区域，另有5%患者基因突变发生在TAD区域。12例T-ALL患者PHF6基因突变发生情况如下：2例错义突变，4例移码突变，6例无义突变。其中2例患者在相同的碱基位置发生基因突变成终止密码子，其他的基因突变类型文献中均有过报道。4例T-ALL患者WT1基因突变发生情况：1例患者在9号外显子462位氨基酸发生了错义突变（R462W），而其他的患者均在7号外显子区域发生移码突变。88例患者中，均未检测到LMO2基因突变。但是，我们发现LMO2基因的2个SNP位点（rs2038602和 rs3740617）。而LMO2基因重排阳性患者和重排阴性患者，FBXW7(P=0.168)、IL7R(P=0.252)、NOTCH1(P=0.956)、PHF6(P=0.265)和 WT1(P=0.252)基因突变的发生情况无明显统计学差异。　　对于22例有足量基因组DNA的T-ALL患者，我们进行了比较基因组杂交检测，从而发现这些患者 DNA拷贝数的变化。通过检测我们发现，22例 T-ALL患者有1种或以上的基因组水平的异常，一共有87种基因组水平的改变或者缺失，平均每个病人有3.9种异常。在这些异常中，发生率最高的是CDKN2A基因的缺失（36.4%,8/22）。融合基因SET-NUP214、 SIL-TAL1、 NUP214-ABL1的发生率分别为13.6%（3/22）、9.1%（2/22）、4.5%（1/22）。我们发现多种参与到白血病疾病发生发展的基因DNA拷贝数变化，如MYB基因的扩增(1/22,4.5%)，CDKN2A(8/22,36.4%)、WT1(3/22,13.6%)、LEF1(2/22,9.1%), LMO2(2/22,9.1%)、RB1（1/22,4.5%）、PHF6（1/22,4.5%）、ETV6（1/22,4.5%）等基因的缺失。我们用BAC克隆RP11-646J21和RP11-278N12制备的FISH探针，验证出array-CGH发现的2例T-ALL患者中LMO2基因上游的微缺失。　　2.2例LMO2基因重排阳性的T-ALL患者LMO2对手基因研究情况　　通过全基因组测序检测及后期结果验证，发现病例1的LMO2基因所在的11号染色体与TCRB基因所在的7号染色体同时发生了断裂并重新连接，因此初步推测为染色体易位t(7;11)(q35;p13)。我们首先应用BAC克隆RP11-1084E14和RP11-114L10检测病例1是否发生了TCRB基因重排，结果显示该病例TCRB基因重排阳性。接着，我们根据全基因组测序的结果分别应用BAC克隆RP11-646J21和RP11-114L10检测该病例是否同时发生LMO2基因和TCRB基因融合，结果显示为融合阳性。我们设计出LMO2基因融合位置的PCR引物，经过基因组DNA水平的PCR及PCR产物测序，我们发现病例1确实为染色体易位t(7;11)(q35;p13)，LMO2基因的对手基因为TCRB基因。病例2的LMO2基因所在的11号染色体与14号染色体长臂3区2带同时发生了断裂并重新连接，因此初步推测为染色体易位 t(11;14)（p13;q32）。该患者14q32区域断裂位点位于BCL11B基因下游，我们根据全基因组测序的结果分别应用BAC克隆RP11-2348N10和RP11-74H1检测该病例是否发生BCL11B基因重排，结果显示为重排阳性。因此，病例2同时发生了LMO2和BCL11B基因重排，LMO2基因的对手基因为BCL11B基因。我们设计出LMO2基因融合位置的PCR引物，经过基因组 DNA水平的PCR及 PCR产物测序，我们发现病病例2确实为t(11;14)(p13;q32)。　　结论:　　1．本试验通过对T-ALL患者中LMO2基因重排进行筛选，发现在T-ALL中LMO2基因重排是一种再现性较高的事件，LMO2基因重排阳性的T-ALL患者该基因表达也相对较高，LEF1基因表达具有相互促进的作用。LMO2基因重排与NOTCH1等基因突变之间无相关性，提示T-ALL患者中LMO2基因重排是主要遗传学事件。　　2．通过全基因组测序技术对2例LMO2基因重排阳性的T-ALL患者进行LMO2基因断裂位点的精确定位和对手基因的检测，发现了在T-ALL中一种新的染色体易位t（11;14）（p13;q32）以及LMO2基因的对手基因-BCL11B。这种新的易位通过与BCL11B基因3’端的增强子的并置，导致LMO2基因的活化，参与T-ALL的致病。

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第一部分264例初诊急性T淋巴细胞白血病患者LMO2基因重排、表达及相关基因突变研究

引言

病例资料

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分全基因组测序检测2例T-ALL患者LMO2基因重排的对手基因

引言

病例资料

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述一:The advances in cytogenetics and molecular biology findings of T-cell acute lymphoblastic leukaemia

综述二:LMO2基因在血液系统疾病中的研究进展

攻读学位期间公开发表的论文

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