斑马鱼cry1.1a基因在生物钟调节和免疫应答中的作用机制

摘要

自然界各类生物从原核单细胞生物、低等生物、高等动植物直至人类都呈现以大约24小时为周期的生物节律，即生物钟。生物钟的运转是由一组生物钟基因调控的。生物钟基因突变可使机体生物节律周期延长或缩短、相位前移或延迟、振荡幅度增大或消减，从而造成机体与环境失去同步，导致机体的健康严重受损。因此，研究生物钟的分子机制对于阐明生物钟周期节律紊乱引发的相关疾病机理有重大意义。　　斑马鱼是一种重要的研究生物钟调节机制的模式动物。研究表明，斑马鱼生物钟主要分为核心生物钟(core loop)和外周生物钟(peripheral loop)。其中核心生物钟是由一个负反馈回路构成：Clock和Bmal蛋白结合形成异二聚体，作用于负向调节因子 per和cry启动子上游的E/E’-box元件(CACGTG)来激活其它们的转录。随后，Per和Cry蛋白结合形成异二聚体并进入细胞核内，与Clock: Bmal复合体作用，抑制其转录激活作用，从而反向抑制自身转录。　　斑马鱼拥有六个cry基因，由于不同的序列和功能，这些cry基因呈现不同的表达谱。研究显示，cry1.1a在中午的表达量最高,受机体内生物钟和外界光因素的双重调控，而其它 cry只受生物钟控制。与斑马鱼 per2启动子上 D-BOX相类似的是，cry1.1a启动子区域也有光应答模块（LRM）。此外，研究报道小鼠钟基因 Cry1和Cry2的缺失对机体免疫应答反应有很大影响，相关炎症因子如 NF–κB家族、TNF-a等分子水平发生明显变化。　　利用新的基因修饰技术 TALEN，我们使得 cry1.1a基因第一个外显子发生碱基缺失并且移码突变，导致蛋白翻译提前终止，从而建立了斑马鱼 cry1.1a突变体。荧光定量 PCR显示，核心钟基因 per1a、per1b、per2、per3、cry1.1b、cry1.2a、cry1.2b以及 cry2和cry3在 cry1.1a纯合子突变体中明显上调，揭示Cry1.1a可能抑制这些基因的表达。行为学实验分析进一步发现，cry1.1a纯合子突变体在光照/黑暗循环条件下活动量比野生型高；在持续黑暗条件下，相较于野生型，突变体运动节律的相位后移了两小时，这一结果与Cry1敲除的老鼠的表型是一致的。通过对野生型和突变体幼鱼的光照处理发现，随着光处理的时间增加， cry1.1a表达量也不断上升。在不同时间点， cry1.1a受光诱导的效果不同，早晨的光诱导效果明显好于傍晚。此外，利用大肠杆菌内毒素 LPS诱导斑马鱼胚胎产生免疫应答，结果发现 cry1.1a的缺失使得突变体更容易产生免疫反应，相关炎症因子TNF-a和IL8的基因表达量在LPS感染后明显升高，敏感性高于野生型。　　上述研究结果揭示了Cry1.1a在斑马鱼生物钟调节环路中起到不可或缺的作用，尤其是能够抑制斑马鱼 per基因和cry基因的转录，并且光对cry1.1a的诱导作用也与生物钟调控密切相关。本研究注重在斑马鱼突变体内研究生物钟基因cry1.1a缺失后的表型，并通过实验分析验证 cry1.1a对部分免疫相关因子的调控作用，将斑马鱼生物钟与生理生化过程联系起来，从而为免疫等相关的疾病提供了新的治疗思路。

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第一章文献综述

1.1斑马鱼作为模式生物的优点

1.2生物钟概述及其与疾病的关系

1.3生物钟的分子机制

1.4 Cry

1.5斑马鱼cry1.1a与光信号调控

1.6生物钟基因cry在免疫调节通路中的作用

1.7 TALEN技术概述及应用

1.8立题意义及主要研究内容

第二章 材料与方法

2.1实验动物

2.2菌株和细胞系

2.3实验仪器及生产厂家

2.4实验试剂

2.5常用溶液与试剂的配制方法

2.6实验设计与方法

第三章 cry1.1a突变体构建

3.1 cry1.1a基因在早期斑马鱼幼鱼中的振荡表达

3.2 cry1.1a TALENs靶位点筛选

3.3 TALEN元件组装原理及突变体的初步构建

3.4 cry1.1a TALEN F2纯合突变体的筛选

第四章 cry1.1a突变体结果分析

4.1 Cry1.1a蛋白缺失影响斑马鱼生物钟、行为和生理现象

4.2突变体中cry1.1a功能检测

4.3生物钟基因per和cry在cry1.1a突变体中的变化

4.4荧光定量PCR和行为学实验分析cry1.1a突变体与野生型的基因表达和运动节律的变化

4.5光诱导cry1.1a基因的转录表达

4.6 cry1.1a缺失对LPS感染引起的免疫应答的影响

第五章 讨论

5.1斑马鱼cry1.1a突变体的构建意义

5.2 cry1.1a对斑马鱼行为运动节律的影响

5.3 cry1.1a受光照诱导调控转录

5.4 cry1.1a参与调控LPS诱导的斑马鱼炎症反应

参考文献

研究生期间已发表和待发表的论文

致谢