基于分子标记手段辅助灵芝育种的研究

摘要

灵芝（Ganoderma lucidum）是中国传统的药用真菌。随着灵芝大规模育种和栽培产业的扩大化发展，对灵芝遗传育种的研究提出了新的要求，通过现代分子标记技术辅助灵芝遗传育种对简化育种过程、减少育种盲目性具有重要意义。本研究通过建立羧甲基纤维素钠筛选模型对127株灵芝菌株进行筛选，以其中3株灵芝菌种为出发材料，通过制备原生质体单核体、交配型测定、ISSR、RAPD、SRAP、亲缘关系分析、杂交育种、主要生物学性状关联性分析等技术进行了灵芝遗传育种的研究。主要研究结果如下:　　1、从建立的羧甲基纤维素钠筛选灵芝菌株分解纤维素能力大小的模型中挑选出G0119、G0130和G0154为出发材料，其中G0119和G0154相比于其他灵芝菌株，分解纤维素能力较强，而G0130分解能力弱。本论文建立的羧甲基纤维素钠实验模型与研究结果对丰富灵芝的育种方法和扩展灵芝种质资源库有积极的科学价值。　　2、采用原生质体单核化的方法成功制备得到109株单核体，其中G0119、G0130和G0154的单核体数量分别为34株、36株和39株。并发现原生质体单核化的概率与培养天数有关，即培养天数越长，原生质体单核化率越高，同时对得到的单核体菌株进行了交配型测定，结果显示不同交配型的单核体具有明显的形态差异。　　3、综合利用三种分子标记技术，即ISSR、RAPD以及SRAP对获得的109株原生质体单核体进行了遗传多样性的测定，并采用UPGMA法构建了菌株的遗传关系聚类图。聚类结果显示，虽然出自同一个出发菌株，但是单核体间存在差异。另外，比起单单利用某一种分子标记手段，综合采用三种标记手段能更有效、更准确地反映菌株间遗传差异。　　4、单核体杂交共计得到63株杂交子，杂交成功概率为0.80％，根据形成杂交子的亲本不同，将其分为G、T和Z三个系列，经拮抗实验验证，这63株杂交子均不同于出发的亲本菌株，是新的菌株。　　5、对杂交菌株综合采用ISSR、RAPD以及SRAP这三种分子标记研究它们的遗传多样性，通过聚类分析得到它们的遗传距离关系图谱，发现杂交子菌株的遗传多态性均较丰富，没有出现两个杂交子被完全聚类在一起的现象，且G、T和Z三个系列的杂交子均能够被有序地分开。　　6、从遗传系数（GS值）入手，分析了杂交子与其亲本之间的GS值，并结合GS值的差异探讨了菌株生物学性状的差异，这些差异包括生长速度、生物量、蛋白含量、多糖含量、纤维素酶活性等。结果显示，杂交子遗传差异的产生是由于形成其亲本单核体的差异造成的，且菌株间的GS值越大，则它们的生长速度、生物量以及纤维素酶活性则越接近，反之，则相差越大。但对于多糖含量与蛋白含量这两类生物学性状而言，GS值却没有表现出明显的相关性。　　7、杂交子的纤维素酶活性均不低于亲本菌株，这表明通过分子标记辅助育种筛选得到的杂交菌株具有不低于亲本菌株的纤维素酶活性以及生物转化率;同时，利用GS值可以考察生物量与生长速度带来的产量变化，通过筛选GS值相异的杂交菌株，可以快速判断生物量与生长速度的差异，从而减少亲本选择带来的筛选冗余。通过GS值的判断，可以了解菌株间的遗传距离，近而有助于简化育种过程，减少育种时间过程和降低育种盲目性。同时，获得的63株杂交子将进行出菇实验，结合出菇性状，可以为后期的大规模育种和栽培推广提供优良的种质资源。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

第一节 灵芝研究慨况

1 灵芝简介

2 灵芝的营养价值

第二节 大型真菌育种研究进展

1 驯化育种

2 诱变育种

3 单孢杂交育种

4 原生质体单核化杂交育种

5 其他育种方法

第三节 DNA分子标记技术在大型真菌中的应用

1 随机扩增多态性(Random Amplified Polymorphie DNA，RAPD)

2 相关序列扩增多态性(Sequence Related Amplified Polymorphism，SRAP)

3 简单重复序列间扩增(Inner Simple Repetitive Sequence，ISSR)

4 其他DNA分子标记技术

第四节 论文的研究目的和意义

第二章 高纤维素分解能力菌株的筛选及单核体交配型的确定

第一节 高纤维素分解能力菌株的筛选

前言

1 实验材料

2 实验方法与步骤

3 实验结果与讨论

第二节 原生质体的制备与再生

1 实验材料

2 实验方法与步骤

3 实验结果与讨论

第三节 原生质体单核体交配型的确定

1 实验材料

2 实验方法与步骤

3 实验结果与讨论

4 本章小结

第三章 单核体分子标记多态性的测定

前言

1 实验材料

2 实验方法与步骤

3 实验结果与讨论

4 本章小结

第四章 杂交菌株的获得及其分子标记多态性的测定

前言

第一节 杂交菌株的获得

1 实验材料

2 实验方法与步骤

3 实验结果与讨论

第二节 杂交菌株分子标记多态性的测定

1 实验材料

2 实验方法与步骤

3 实验结果与讨论

4 本章小结

第五章 单核体与杂交子之间的关联性分析

前言

第一节 单核体分子多态性影响其杂交子之间的多态性

1 实验材料

2 实验方法与步骤

3 实验结果与讨论

第二节 杂交子重要生物学性状的关联性分析

1 实验材料

2 实验方法与步骤

3 实验结果与讨论

4 本章小结

第六章 全文总结

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文