昆虫基因组注释方法改进及两种昆虫基因组分析

摘要

基因组包含了物种全部的遗传信息，是人们了解和改造生物的基础。因此，基因组测序是生物学研究中一项基础而又十分重要的工作。作为地球上种类最多的动物种群，昆虫对人类生活有着十分重要的影响，人们对昆虫基因组序列的需求越来越迫切。随着测序技术进步，测序成本快速下降、测序通量急速提高，昆虫基因组测序越来越普遍。本文建立和优化了昆虫基因组注释方法，对二化螟(Chilo suppressalis)和腰带长体茧蜂(Macrocentrus cingulum)两个农业昆虫基因组进行了组装、注释和分析。研究结果如下:　　一、昆虫基因组注释平台构建和优化　　昆虫杂合度高，增加了基因组拼接的难度，导致基因组注释质量不高。为此，本文构建了昆虫基因组注释平台Optimized Maker Based Insect GenomeAnnotation(OMIGA)，优化和改进了昆虫基因组的注释方法。首先，建立了计算流程，从转录组数据中挖掘出结构完整的蛋白编码基因，用于从头预测软件的训练，明显提高了基因预测的准确性。其次，从RNA-seq数据中获取基因表达的证据，解决了表达证据不足的问题。再次，整合了同源比对、从头预测和基因表达等三方面的证据，获得高质量的蛋白编码基因集，保证了蛋白编码基因的注释质量。最后，设计和比较了4种不同的基因组注释策略，结果表明OMIGA注释结果最优。　　二、低N50二化螟基因组注释和分析　　二化螟属鳞翅目螟蛾科，是我国重要的水稻害虫。二化螟进行基因组测序，对研究二化螟的危害习性、抗药性机理以及生长发育规律等具有重要的意义。　　1、构建了190bp、380bp、500bp和700bp共4个小片断文库，测序获得20.44Gb数据，分别利用SOAPdenovo，SOAPdenovo2和AbySS等三个软件进行了基因组组装，最优结果是scaffold N50为5.2 Kb。17-mer分析表明，二化螟基因组GC含量为35.78％，大小为824Mb，杂合度为1.5％，为高杂合度基因组。　　2、CEGMA分析表明，该基因组虽然N50偏低，但含有76.6％的蛋白编码基因，其中48％具有全长。利用OMIGA平台对低N50二化螟基因组进行了注释，发现10，211个蛋白编码基因，其中9，720个基因在家蚕中具有同源基因，5，651个蛋白基因的上游能够预测到可靠的启动子。　　3、发现了1，342选择性剪接事件，涉及1，167个基因，发现选择性剪接的基因比例为11.4％，明显低于果蝇(～70％)，可能与二化螟基因组拼接长度偏低，转录组数据不够丰富有关。其中，42.4％为3'端可变剪接，25.4％为5'端可变剪接，17.8％为外显子跳跃，14.4％为内含子保留。　　4、利用实验室早期测序获得的小RNA文库，采用miRDeep2软件，预测获得了262个微小RNA，其中45个为新基因，217个为保守的微小RNA，表明低N50基因组在非编码RNA基因预测中可发挥重要的作用。　　5、预测发现了126个细胞色素P450基因(cytochrome P450，CYP)，数量与赤拟谷盗相似(135个CYP)，多于家蚕（82个）和帝王蝶（75个）。发现了和抗性相关的CYP314A1、CYP4M7基因。　　6、发现了29个气味结合蛋白基因(OBP)、12个化学感受蛋白基因(CSP)以及主要的RNAi通路核心基因(AGO，Aubergine，piwi，exp-5, PARP, dicer-1，dicer-2和sid-1)。　　三、腰带长体茧蜂基因组组装、注释和分析　　腰带长体茧蜂属膜翅目姬蜂总科茧蜂科，具有多胚发育特征，专一性寄生亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis），被大量用于玉米螟的生物防治。基因组测序可为深入了解寄生蜂的寄生行为、多胚发育特性及生物防治提供重要的参考。　　1、构建了180bp、500bp、800bp三个小片段文库和一个8Kb大片段文库，总共获得了103.67Gb的数据。使用contig组装、scaffold构建和补洞填充等策略对腰带长体茧蜂基因组进行了拼接，获得132Mb基因组序列，contig的N50为64Kb，scaffold的N50为192Kb。CEGMA评估表明，该基因组包含了99％以上的基因，表明拼接完整性很高。　　2、以500bp滑动窗在基因组上进行GC含量分析，发现两种寄生蜂的分布模式相似，但与蜜蜂明显不同。腰带长体茧蜂的重复序列占基因组的24.9％，丽蝇蛹集金小蜂占42.1％，蜜蜂占13.6％。　　3、预测发现了12，593个蛋白编码基因。腰带长体茧蜂基因的平均外显子数量为4.66、平均内含子长度为473 bp，比丽蝇蛹集金小蜂和意大利蜜蜂小，而平均外显子却更长，这种“紧凑”的基因结构可能是腰带长体茧蜂基因组小的原因之一。对15个物种（其中13个为昆虫）的直系同源基因开展进化分析，表明:1）膜翅目昆虫的分化速度介于双翅目和鳞翅目之间;2）膜翅目锥尾组的分化速度比针尾组更快;3）膜翅目姬蜂总科比小蜂总科更接近针尾组的蜜蜂科。　　4、发现了9个OBP基因、82个OR基因、5个CSP基因、26个G-蛋白偶联受体基因、33个离子型受体基因，33个CYP基因、9个GST基因、28个羧酸酯酶基因。腰带长体茧蜂的OBP、OR、CSP和P450基因数量明显比丽蝇蛹集金小蜂少，可能因为腰带长体茧蜂是专一性寄生昆虫，而金小蜂是非专一寄生昆虫有关。　　5、识别了21种毒素蛋白，比金小蜂(71种)和蜜蜂(27种)都少。茧蜂和金小蜂之间毒素蛋白的序列相似性更高，3种蜂均具有各自特异的毒素蛋白。　　6、识别了dsx、ix、msl-3、dpn、mle、emc、mof、 run、sc、Trl、Tra、Tra2等与性别决定相关的基因。Tra基因可能是膜翅目昆虫特有的基因，在膜翅目昆虫性别决定过程中发挥重要作用。　　7、腰带长体茧蜂采用免疫逃避机制躲避寄主的免疫攻击。多聚糖生物合成与代谢通路被认为与免疫逃避机制相关。分析表明，蜜蜂和果蝇缺失了多聚糖降解通路上的lacZ基因。腰带长体茧蜂具有E3.2.1.24、AGA、FUT13、FNG、OGT等基因，为研究寄生蜂免疫逃避提供了重要的线索。　　8、腰带长体茧蜂具有多胚发育现象。分析表明，细胞粘连分子通路上的integrin-β基因出现了扩增，具有两个拷贝，该基因已被证实能调控多胚发育。通过对不同发育阶段基因的表达量分析，发现在粘着连接通路上的SMAD2基因，紧密连接通路上的SYMPK、KRAS、EXOC4、ACTB_G1以及gap junction通路上的HRAS、TUBA、TUBB、PRKG等基因在卵期特异性地高表达，可能参与了多胚发育调控。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 引言

2 基因组学研究相关技术

2．1 基因组测序技术

2．2 基因组组装

2．3 基因组注释

3 昆虫基因组测序现状及存在的问题

3．1 昆虫基因组测序现状

3．2 昆虫基因组测序存在的困难

4 本文研究目的和意义

第二章 昆虫基因组注释方法优化与平台构建

1 引言

2 材料和方法

2．1 数据准备

2．2 重复序列的注释

2．3 转录证据的收集

2．4 从头预测证据收集

2．5 同源证据收集

2．6 三类证据整合

2．7 从头预测基因的重新评估

3 结果与分析

3．1 OMIGA注释平台流程

3．2 OMIGA注释结果评估

4 讨论

第三章 二化螟基因组组装、注释和分析

1 引言

2 材料和方法

2．1 昆虫

2．2 基因组、转录组测序和组装

2．3 编码基因和重复序列注释

2．4 直系同源分析

2．5 可变剪接

2．6 GO分析

2．7 microRNA基因

3 结果与分析

3．1 基因组组装

3．2 编码基因注释

3．3 重复序列注释

3．4 可变剪接

3．5 P450基因家族

3．6 OBP和CSP基因家族

3．7 RNA干扰通路的核心基因

3．8 microRNA

4 讨论

第四章 腰带长体茧蜂基因组组装、注释和分析

1 引言

2 材料和方法

2．1 基因组和转录组测序

2．2 基因组组装

2．3 基因组总体特征

2．4 非编码RNA注释

2．5 蛋白编码基因注释

2．6 直系同源及基因组微共线性分析

2．7 基因家族识别和分析

2．8 代谢通路注释

3 结果与分析

3．1 基因组组装和特征分析

3．2 基因组注释和进化分析

3．3 寄主搜索

3．4 解毒代谢

3．5 毒性蛋白

3．6 免疫逃避

3．7 多胚发育

3．8 性别决定

4 讨论

第五章 全文总结与展望

1 全文总结

2 论文创新点

3 展望

参考文献

附录

攻读博士期间论文发表情况

致谢