交链孢菌基因p42A的原核表达、纯化及生物信息学分析

摘要

本文以cDNA文库筛选到的p42A基因为材料，构建原核表达载体，并进行目的蛋白的表达和纯化，同时对p42A基因及其编码的蛋白质进行生物信息学分析，为从结构和分子水平进一步研究激活蛋白及其作用机理奠定基础。结论如下： 1.利用分子生物学方法，采用通用ITS引物成功地克隆了一株真菌的ITS区段，经与GeneBank所有序列进行Blast，结果与链格孢属Alternariaspp.的ITS区段完全相同。 2.通过聚合酶链式反应(PCR)，扩增出含酶切位点的p42A基因片段，并将该基因按正确阅读框分别克隆到融合表达载体pGEX-KG及非融合表达载体pBV221上，经鉴定证明，融合及非融合表达载体均构建成功且获得表达。对融合表达和非融合表达情况进行比较发现，前者表达量较高，而后者表达量很低。 3.对融合表达的质粒进行培养，建立菌液生长曲线，通过菌液密度、诱导剂浓度、诱导时间和温度等条件的摸索，获得融合蛋白的最佳表达条件。结果表明，最佳诱导时间为培养后4h；诱导剂IPTG的最佳浓度为1.0mmol/L；37℃下诱导培养4h时产物表达量最高。通过超声波破碎菌体细胞，离心及电泳发现，表达产物为可溶性蛋白。 4.对表达的融合蛋白进行“两步法”纯化：先通过亲和层析柱纯化获得融合蛋白，利用凝血酶切割除去GST标签，再通过亲和层析柱纯化获得目的蛋白。对融合蛋白利用WesternBlot进行特异性鉴定，进一步确定了杂交带即为连接了GST标签的融合蛋白带。 5.采用P42A蛋白液浸泡小麦种子后，对小麦生长初期体内抗氧化酶活性和丙二醛含量进行测定。结果处理的小麦SOD活性和POD活性高于对照；小麦体内MDA含量基本上均低于对照。说明作为激活蛋白的辅助蛋白-P42A蛋白液浸泡小麦种子后，可以增强小麦体内抗氧化能力，并能显著提高小麦幼苗的抗性。 6.采用多种方法进行生物信息学分析，p42A基因编码蛋白质的搜索结果显示，该蛋白与TCTP蛋白家族序列相似性程度很高，达61.0％。二级结构预测结果表明，该蛋白质随机卷曲含量丰富，达46.15％。对P42A蛋白进行模体搜索表明为单结构域蛋白，通过同源模建获得了P42A蛋白的三级结构。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

1文献综述

2引言

3材料与方法

4结果与分析

5讨论

6结论

参考文献

致谢

附录

作者简介