基于发根体系的甘薯茎线虫病研究及甘薯遗传转化体系建立

摘要

本文以发根农杆菌诱导的甘薯发根为技术体系，研究在发根体系上培养甘薯茎线虫可行性，同时发展了利用该体系鉴定甘薯品种抗线虫的特性以及评价杀线剂的杀线作用等研究，探索了甘薯遗传转化体系的建立。 1.在研究胡萝卜、甘薯发根单寄主培养无菌线虫体系的基础上，以甘薯品种徐薯18的试管苗为材料，用发根农杆菌菌株ACCCl0060(携带质粒RiA4b)诱导出徐薯18发根，将甘薯茎线虫接种到发根上构建发根培养线虫体系。通过该体系对甘薯茎线虫的繁殖情况进行调查。结果表明：甘薯茎线虫在MS、MSR培养基的发根上都能生长发育和繁殖，完成其生活周期；为了方便观察，选用MSR培养基发根上培养的线虫开展研究，在26℃，9c111的培养皿中，发根上线虫的适宜接种密度为100条/皿，30d后线虫可繁殖4.3倍左右，在此体系中，线虫的卵孵化时间为4d左右。 2.用病地自然诱发鉴定高感甘薯茎线虫病品种徐薯18、栗子香和高抗品种鲁78066的发根体系接种甘薯茎线虫，6周后调查发根繁殖线虫情况及线虫侵染发根情况，然后评价它们的抗线虫特性。结果表明：接种6周后，线虫在徐薯18、栗子香和鲁78066发根上繁殖倍数分别为8.82、0.76和0.70；发根染色后观察到徐薯18有多处被线虫侵入，栗子香和鲁 78066被线虫侵入位点较少；基于以上结果，鉴定徐薯18为高感甘薯甘薯茎线虫病品种，栗子香和鲁 78066为高抗甘薯对线虫病品种；徐薯18和鲁 78066对线虫病抗性鉴定结果和病地自然诱发鉴定结果相一致，栗子香鉴定结果不同于病地自然诱发鉴定结果，可能是因为植物对线虫的抗性机制不同；本研究鉴定结果具有体系简单、直观方便、重复性好以及不受自然环境影响等优点，进一步完善有望发展为植物对线虫病抗性鉴定新的体系。 3.进一步对徐薯18和鲁78066发根游离氨基酸组成及含量的分析表明：感病品种徐薯18发根在游离氨基酸组成上较抗病品种鲁78066多出3种游离氨基酸，它们分别是：谷氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸；接种线虫2周后，徐薯18和鲁 78066发根游离氨基酸含量均有不同程度的下降，感病品种徐薯18被线虫利用的每种游离氨基酸的量均明显多于抗病品种鲁 78066；在鲁 78066发根培养基中补加氨基酸试验表明：在分别补加了100mg/L丙氨酸和苯丙氨酸的MSR培养基中，其发根上接种的甘薯茎线虫繁殖数量明显增加，仅3周线虫繁殖数分别是未添加氨基酸的鲁78066发根对照的2.28和1.77倍。 4.选用生产上防治甘薯茎线虫病效果较好的杀线剂：40％甲基异柳磷乳油、50％辛硫磷和0.2％红竽宝以及植物源农药0.3％印楝素乳油，用发根体系来评价它们的杀线活性。结果表明：40％甲基异柳磷乳油、50％辛硫磷和0.2％红竽宝对甘薯茎线虫都具有很强的杀线虫活性，测定结果和田间测定结果相一致；对环境友好的植物源农药0.3％印楝素乳油对甘薯茎线虫同样具有很强的杀线虫活性；说明用发根体系评价杀线剂对甘薯茎线虫的杀线活性是可行的。 5.为了探索通过转基因途径获得抗茎线虫病的甘薯品种的可行性，建立了甘薯品种栗子香的胚性悬浮细胞培养系，用根癌农杆菌菌株C58C1对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化进行了系统的研究。该菌株所携带的pCB2002H质粒上含有除草剂抗性基因 Bar 基因。结果表明，有效的转化方法是：用甘薯栗子香胚性细胞悬浮培养技术获得大量胚性悬浮细胞，将胚性悬浮细胞团(直径小于1.0mm)转移到MS+2，4－D2.0mg/L固体培养基上预培养一周后作为受体，侵染菌液浓度OD值为0.8，在固体MS+2，4－D2.0mg/L 培养基上共培养3天，在附加100mg/L 羧苄青霉素和10mg/L除草剂的MS+2，4－D2.0mg/L 固体选择培养基上筛选抗性愈伤组织，选择4-6周后将除草剂抗性愈伤转移到附加100mg/L羧苄青霉素和10mg/L除草剂的MS+ABA1.0mg/L固体培养基上使体细胞胚发育成熟并发芽。用此方法转化380个细胞团，共获得了除草剂抗性愈伤组织12个，愈伤组织都陆续形成了体细胞胚，体细胞胚进一步发育成熟并发芽形成植株，为下一步的研究打下基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

第二章发根培养甘薯茎线虫体系的构建

2.1材料与方法：

2.1.1发根农杆菌

2.1.2菌株的活化和菌液的制备

2.1.2植物材料

2.1.3发根的诱导

2.1.4发根的选取与培养

2.1.5 DNA的提取和PCR检测

2.1.6病原物的分离与纯化

2.1.7发根培养马铃薯腐烂线虫体系的构建

2.1.8无菌线虫的分离与培养

2.1.9培养基和线虫接种密度对甘薯发根繁殖线虫的影响

2.2结果和分析

2.2.1发根农杆菌转化胡萝卜和甘薯发根产生及扩繁

2.2.2转化发根的PCR检测：

2.2.3病原线虫的分离和纯化过程

2.2.4马铃薯腐烂线虫侵染发根情况

2.2.5发根繁殖马铃薯腐烂线虫情况

2.2.6无菌线虫的分离与继代培养方法

2.2.7培养基对甘薯发根培养线虫的影响

2.2.8线虫接种密度对甘薯发根上线虫繁殖率的影响

2.3 讨论

2.3.1发根培养线虫体系

2.3.2不同寄主植物对线虫繁殖的影响

2.3.3发根繁殖线虫的影响因素

2.3.4发根培养线虫体系的应用

第三章发根体系鉴定甘薯品种抗线虫特性的研究

3.1材料与方法：

3.1.1植物材料

3.1.2发根的诱导、选取与扩繁

3.1.3转化发根的PCR检测

3.1.4甘薯发根培养线虫的致病力测定

3.1.5线虫的分离和接种

3.1.6线虫繁殖计数、分析与显微观察

3.1.7评价甘薯品种对线虫的抗性情况

3.1.8甘薯发根游离氨基酸含量对线虫繁殖的影响

3.2结果与分析

3.2.1发根农杆菌转化甘薯发根产生及扩繁

3.2.2转化发根的PCR检测：

3.2.3发根体系培养的线虫致病力

3.2.4甘薯不同品种发根繁殖马铃薯腐烂线虫情况

3.2.5马铃薯腐烂线虫侵染发根情况

3.2.6甘薯发根培养体系鉴定甘薯品种对线虫病的抗性情况

3.2.7甘薯发根游离氨基酸提取方法的确定

3.2.8不同抗线虫特性甘薯品种发根游离氨基酸的含量

3.2.9培养基中补加氨基酸对发根繁殖线虫的影响

3.3讨论

3.3.1发根体系鉴定甘薯品种抗线虫特性

3.3.2游离氨基酸与植物的抗病虫性

3.3.3甘薯品种的抗线虫病机制

第四章发根体系评价杀线剂的杀线活性研究

4.1材料与方法

4.1.1杀线剂的选取

4.1.2杀线剂对发根的药害测定

4.1.3线虫的准备

4.1.4杀线活性测定

4.2结果与分析

4.2.1杀线剂对发根的药害测定结果

4.2.2杀线剂的杀线活性测定结果

4.3讨论

4.3.1杀线剂的杀线活性评价方法

4.3.2杀线剂的杀线活性

第五章甘薯胚性细胞遗传转化体系的建立

5.1材料与方法

5.1.1植物材料

5.1.2根癌农杆菌和质粒

5.1.3实验仪器、设备、培养基以及各种试剂的配制

5.1.4甘薯胚性悬浮细胞对除草剂的敏感性分析

5.1.5甘薯胚性细胞的转化和植株再生

5.1.6转基因植株的分子检测

5.2结果与分析

5.2.1甘薯品种栗子香的胚性细胞悬浮培养系的建立

5.2.2适宜选择压的确定

5.2.3除草剂抗性愈伤的形成和转基因植株的再生

5.2.4转基因植株的PCR检测

5.3 讨论

5.3.1外植体的种类对甘薯遗传转化效率的影响

5.3.2转化方法对甘薯遗传转化的影响

5.3.3农杆菌的菌株特性对转化效率的影响

5.3.4选择方法对转化频率的影响

第六章结论与展望

结论：

展望：

参考文献

附录

致谢

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