抗除草剂bar基因工程菌构建与草莓叶片再生体系的研究

摘要

为探索草莓抗除草剂bar基因转化高效方法,试验利用三亲杂交法,将构建的真核表达载体pBI121-bar转入根癌农杆菌菌株LBA4404,对菌落PCR、质粒PCR和质粒双酶切产物进行电泳检测,用构建的工程菌转化草莓试管苗。并且本试验以适合安徽省栽培的草莓(Fragaria ananassa Duch)优良品种-丰香为试材,通过对叶片愈伤组织诱导、生根培养筛选研究,建立起草莓简单、快速、高效的叶片离体再生体系,为草莓利用发根农杆菌进行抗除草剂bar基因转化研究奠定基础。 试验研究获得的主要结果如下： 1、利用三亲杂交法将真核表达载体pBI121-bar转入根癌农杆菌LBA4404,通过菌落PCR、质粒PCR、质粒双酶切电泳检测,证明工程菌构建成功。 2、试验筛选出草莓试管苗、叶片愈伤组织分化阶段的适宜选择压分别是浓度为25 mg/L和20 mg/L的卡那霉素。 3、对工程菌进行抗生素浓度的筛选,Cef与Carb有效抑菌浓度均为200 mg/L。 4、不同6-BA、NAA组合对草莓叶片不定芽无诱导作用,只能诱导愈伤组织。 5、应用SPSS软件分析,得出诱导叶片不定芽的最佳培养基是:MS+TDZ1.5mg/L+IBA 0.4 mg/L。 6、丰香生根的最适培养基分别为是：1/2MS+IBA 0.1 mg/L。 7、对发根农杆菌R1601抑制抗生素Carb浓度筛选,Carb有效除菌浓度为500mg/L。 8、当发根农杆菌R1601的菌液OD600值=0.6时,对草莓叶片毛状根的诱导频率最高,而高于或低于该密度,诱导率都呈下降的趋势。

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声明

1文献综述

1.1草莓离体培养

1.1.1花药培养

1.1.2茎尖培养

1.1.3叶片及匍匐茎的培养

1.2抗除草剂转基因草莓研究进展

1.2.1草莓的转基因研究现状

1.2.2抗除草剂转基因草莓转化的主要方法

1.2.3抗除草剂bar基因遗传转化的检测和鉴定方法

1.2.4抗除草剂转基因草莓研究存在的问题

1.2.5抗除草剂转基因草莓研究的未来发展方向

2引言

3材料与方法

3.1材料

3.1.1质粒与菌种

3.1.2叶片培养材料

3.1.3抗生素

3.1.4培养基

3.2仪器与试剂

3.2.1主要试剂

3.2.2主要仪器

3.3方法

3.3.1抗除草剂bar基因工程菌的构建

3.3.2草莓叶片再生体系的研究

3.3.3发根农杆菌复苏、培养及其诱导草莓叶片毛状根的研究

4结果与分析

4.1真核表达载体pBI121-bar转化大肠杆菌DH5α

4.1.1感受态细胞的转化

4.1.2转化菌落PCR鉴定

4.2载体pBI121-bar转化农杆菌LBA4404

4.2.1工程菌菌落PCR检测结果

4.2.2工程菌质粒PCR检测结果

4.2.3重组工程菌质粒双酶切

4.3工程菌株的构建

4.4两种不同方法对质粒提取的比较

4.5卡那霉素(Kan)筛选浓度的确定

4.6头孢噻肟钠(Cef)抑制转化农杆菌LBA4404浓度确定

4.7羧苄青霉素(Carb)抑制转化农杆菌LBA4404浓度确定

4.8草莓叶片再生体系的研究

4.8.1不同浓度6-BA，NAA对草莓叶片再生的影响

4.8.2不同浓度TDZ、IBA对草莓叶片再生的影响

4.9不同浓度IBA对生根的影响

4.10毛状根除菌用抗生素浓度的确定

4.11草莓叶片毛状根的诱导

5讨论

5.1真核表达载体的转化农杆菌

5.2抗生素浓度的筛选

5.3草莓叶片再生体系的研究

5.4不同浓度IBA对生根的影响

5.5草莓叶片毛状根的诱导

6结论

6.1抗除草剂bar基因工程菌的构建

6.2草莓选择压及工程菌抑制浓度的筛选

6.3草莓叶片再生体系的研究

6.4毛状根除菌用抗生素浓度的确定

6.5草莓叶片毛状根的诱导

参考文献

附图表

致谢

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