产耐高温淀粉酶菌株的筛选及离子束诱变研究

摘要

淀粉和糖原是发酵工业中最常用的有机物质资源,目前对淀粉和糖原降解利用多数是通过化学的方法,但化学方法成本较高,而利用微生物有更多的优点,例如环保、成本低。微生物发酵多数是高温在下进行的,但能在高温下把淀粉和糖原降解的耐高温α-淀粉酶产生菌种类较少,因此对耐高温α-淀粉酶产生菌的筛选及人工改造是未来淀粉利用的重要途径。本研究通过对多种不同的土壤进行高温淀粉酶菌株筛选和鉴定,利用离子束对筛选菌株进行诱变选育高酶活的突变菌株,并对突变菌的发酵条件和分子变异进行了初步研究,主要结果如下： 1.从安徽具有典型高温环境地区的近100份土样中筛选分离到11株产高温淀粉酶的菌株,对其中一株酶活较高的菌株RL,经形态观察、16SrDNA测序分析,证实该菌株为解淀粉芽孢杆菌。 2.利用Ar+N+两种低能离子注入RL进行诱变,研究存活率和突变率,在相同的能量和剂量下,Ar+诱变存活率低于N+,但是N+注入的平均突变率明显高于Ar+。经过对诱变条件系统地研究,得到出发菌株最适的注入离子为N+,适宜的注入能量为10keV、注入剂量为2.08×1015ions/cm2。 3.经过两轮诱变和筛选,得到了1株高产高温淀粉酶突变菌株RL-1,经传代实验表明该菌株在降解淀粉的遗传性状上表现稳定,测定突变株RL-1酶活提高了57.1％。 4.对RL-1菌株耐高温淀粉酶进行酶学性质分析,结果显示该酶的最适反应温度为75℃,属高温淀粉酶,最适反应pH为6.5,60℃以上保温80 min仍可保持80％左右的酶活力,而温度低于20℃酶活迅速下降。在pH4～9的范围内,具有比较良好的pH稳定性。Ca2+对酶有激活作用,Cu2+、Mg2+、Mn2+对酶活具有不同程度的抑制作用。 5.利用PCR技术,对原始菌株和突变菌株的高温淀粉酶基因进行序列测定,发现高产菌株高温淀粉酶基因序列发生了4个碱基的变化,并导致氨基酸序列的部分改变,这为进一步研究耐高温淀粉酶产生菌突变的分子机制提供了一定的依据。

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论文说明：图表目录

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1 文献综述

1.1淀粉酶概述

1.1.1耐高温α-淀粉酶介绍

1.1.2耐高温α-淀粉酶的应用

1.1.3耐高温α-淀粉酶的开发趋势

1.1.4耐高温α-淀粉酶的研究进展

1.1.5耐高温α-淀粉酶的生产

2.1离子束生物工程学研究进展

2.1.1低能离子注入技术概述

2.1.2低能离子注入的生物效应

2.1.3离子束生物工程学的应用

2.1.4离子束介导转基因研究进展

2.引言

2.1 国内外耐高温α-淀粉酶的研究进展

2.2本研究的内容和目标

2.2.1本研究的内容

2.2.2本研究的目标

2.3本研究的技术路线

3材料与方法

3.1材料

3.1.1土样及菌株

3.1.2培养基

3.1.3主要仪器设备和试剂

3.2方法

3.2.1耐高温淀粉菌株筛选的方法

3.2.2菌种鉴定

3.2.3采用分光光度计法测定酶活

3.2.4菌种保藏

3.2.4低能离子注入诱变选育的方法

3.2.5发酵工艺的研究

3.2.6酶学性质的研究

3.2.7淀粉酶基因序列的测定

4结果与分析

4.1.产高温淀粉酶菌株的筛选

4.2RL常规形态鉴定

4.3分子鉴定：

4.4进化树的构建

4.5 LR菌的诱变选育

4.5.1 N+、Ar+离子注入其存活率与注入剂量间的关系

4.5.2突变率与注入剂量间的关系

4.5.3突变菌株的分离与筛选

4.6遗传稳定性的传代实验

4.7发酵工艺的研究

4.7.1研究LR-1菌株的生长曲线

4.7.2 pH对菌株生长和相对酶活的影响

4.7.3温度对菌株生长和相对酶活的影响

4.7.4培养基的优化

4.8酶学性质研究

4.8.1胞外酶的鉴定

4.8.2酶反应的最适pH

4.8.3酶反应的最适温度

4.8.4金属离子对淀粉酶活性的影响

4.8.5酶的PH稳定

4.8.6酶的热稳定

4.9 LR-1菌株酶活提高的初步分析

4.9.1高温淀粉酶基因的PCR

4.9.2序列测定后的碱基序列比较

4.9.3氨基酸序列分析

5讨论

5.1.产耐高温淀粉酶菌株筛选模型的建立

5.2分子鉴定与进化树的构建

5.3低能离子注入的生物学效应

5.4耐高温淀粉酶酶活力的提高

6.结论

参考文献

附录

致谢

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