球孢白僵菌抗逆相关功能基因克隆与基因工程菌株构建研究

摘要

虫生真菌作为重要的天敌生物资源，具有广阔的应用前景，尤其是其可贵的流行潜力始终吸引着人们。球孢白僵菌Beauveria bassiana（以下简称白僵菌）是害虫微生物防治中一种经典的丝孢类虫生真菌，可侵染15个目149个科的700多种昆虫和若干种蛛螨类。在自然界中它具有分布广、感染力强和扩散流行的特点；同时也具有不污染环境，易于培养，以及防治效果好等优点。因此白僵菌也是研究最多、应用最广和最具有开发潜力的虫生真菌。然而，如同其他真菌杀虫剂一样，球孢白僵菌因为击倒害虫时间长、防效不稳定以及自身抗逆性较差等缺点，目前在农药市场上的占有率依然很低。为延长白僵菌孢子储藏期，增强其环境稳定性，有必要利用基因工程手段对其进行改造，以获得适合市场需要的产品，促进其商品化生产和应用。
　　 海藻糖是广泛存在于各种生物体内的抗逆境剂，具有增强生物体对高温、脱水、干旱、冷冻、高渗透性、重金属及有毒物质等逆境的抵抗能力。胞内海藻糖积累与丝状真菌孢子的储藏期延长密切相关。我们推测，通过基因工程技术改变球孢白僵菌体内海藻糖代谢途径，可以提高孢子内海藻糖含量，增加其抗逆能力。
　　 同样，具有保护细胞功能的热休克蛋白70是热休克蛋白家族中最重要的一类家族成员。它的研究已成为目前生命科学领域研究的热点之一。HSP70蛋白作为一种非特异性保护蛋白，能够防止蛋白质变性和帮助已变性的蛋白重新折叠，恢复正确的构象，具有“分子伴侣”、细胞保护、抗凋亡等独特复杂的生物学功能。因此，对于细胞的生存起着至关重要的作用。通过克隆球孢白僵菌hsp70基因，并深入探讨其表达规律和作用机理对虫生真菌抗逆机制研究具有重要的意义。
　　 我们通过SMART RACE RT-PCR技术从球孢白僵菌Bb202菌株中克隆了海藻糖合成途径中的两个重要基因（海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因tps2）的cDNA序列（GenBank登录号分别为：FJ769373和FJ769375）。并通过DNA步移技术获得了它们各自的上游启动子序列（GenBank登录号：FJ769374，FJ769376）。序列分析表明：球孢白僵菌tps1结构基因含有一个长度为55bp的内含子，位于结构基因的313碱基至367碱基处。其cDNA全序列为1906bp。开放式阅读框由1563个核苷酸组成，编码520个氨基酸，成熟蛋白理论分子量为58.3kDa，理论等电点为5.63。5’非翻译区（5’-UTR）与3’-非翻译区（3-UTR）分别为112bp和263bp。在终止密码子下游3’-UTR有polyA加尾信号AATATA和有26 bp的polyA结构。球孢白僵菌tps1基因上游序列的转录起始位点位于第2785位G碱基处。该上游序列含有TATA-box、GC-box，同时也存在其它多个潜在转录因子结合位点。如：Oct-1结合位点，CRE-BP结合位点，CdxA结合位点以及可与Ⅳ型锌指蛋白（转录因子）相结合的GATA元件等。球孢白僵菌tps2结构基因含有两个长度分别为140bp和62bp的内含子。它们分别位于结构基因的127碱基至266碱基处和2209碱基至2270碱基处。它们均符合真核生物内含子剪接位点5’-GT…AG-3’规则。tps2的cDNA全序列为3219bp。开放式阅读框由2619个核苷酸组成，编码872个氨基酸，成熟蛋白理论分子量为97.8kDa，理论等电点为6.32。5’非翻译区（5'-UTR）与3’-非翻译区（3’-UTR）分别为310bp和290bp。在终止密码子下游含有28bp的polyA结构。球孢白僵菌tps2基因上游序列的转录起始位点位于第4105位C碱基处。该上游序列含有TATA-box、CAAT-box和GC-box，并且也存在其它多个潜在转录因子结合位点。如：cap结合位点，Adf-1结合位点，Oct-1结合位点，C/EBP结合位点，CdxA结合位点等。其中可与Ⅳ型锌指蛋白（转录因子）相结合的GXTA元件含量相当高。
　　 使用同样方法，我们从球孢白僵菌中克隆出了完整的热休克蛋白HSP70基因编码区序列及上游序列。该基因cDNA全长2405bp，5’端非翻译区17lbp，3’端非翻译区263bp，开放阅读框（ORF）1971bp，编码656个氨基酸。成熟蛋白理论分子量为71.3kDa，理论等电点为4.92。得到的上游序列长度3559bp，其中有305bp序列与cDNA序列重叠。分析表明，该上游序列的转录起始位点位于第3255位G碱基处，没有明显的TATA-box和CAAT-box，但含有CCAAT-binding factor、GC-box等重要的转录因子结合位点，以及热激应答元件HSE和GATA元件等启动子顺式调控元件。
　　 通过Realtime-PCR技术，我们对球孢白僵菌tps1和hsp70基因在高温、低温、紫外照射等不同胁迫条件下的转录情况进行了检测。从mRNA转录水平探讨了不同胁迫条件对球孢白僵菌这两个基因表达的影响。结果表明，球孢白僵菌菌丝与孢子中的tps1基因在三种胁迫下转录表达差异较小。而三种胁迫均能诱导球孢白僵菌热休克蛋白基因hsp70的快速高效转录表达。说明球孢白僵菌中tps1与hsp70基因，对于外界逆境影响，具有不同的应答机制。
　　 将克隆得到的球孢白僵菌tps1基因连接到分泌性表达载体pVIC9K上后，通过电转化，转入毕赤酵母GS115。经甲醇诱导获得了60kDa左右的表达蛋白，与预测的结果（58.3kDa）及相关报道结果接近。同时，酶活测定结果表明，表达蛋白具有海藻糖-6-磷酸合成酶生物活性，诱导的粗酶液酶活最高达到1.384U/ml。
　　 将克隆得到的球孢白僵菌tps1基因连接到含有构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子的载体pBARGPE1后，通过芽孢转化，重新转入球孢白僵菌中，对该基因进行组成型表达。抗逆性评价表明tps1基因的组成型表达，在低温下可一定程度增强重组菌株的贮藏性能，相对于出发菌株，重组菌株的活孢率同比提高了约35％。在一定热胁迫范围内，重组菌株耐热性能也得到了提高，相对于出发菌株，重组菌株的活孢率同比提高了约30％。但重组菌株抗紫外能力并没有增强。生物学特性观测表明，重组工程菌株相对于出发菌落生长较慢，且产孢量降低。这些都说明利用组成型表达载体改造虫生真菌抗逆基因，在一定程度上增强了重组菌株孢子的耐贮性和耐热性，但也存在一定的负作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:图表目录、主要缩略词和符号表

声明

第一章文献综述

1.1真菌杀虫剂的特点和发展前景

1.2昆虫病原真菌基因工程研究进展

1.3真菌海藻糖相关研究进展

1.3.1海藻糖的理化性质

1.3.2胁迫环境条件下生物体细胞内海藻糖含量的变化

1.3.3海藻糖对生物分子的保护作用及其可能的作用机制

1.3.4真菌中海藻糖的主要合成途径

1.4热休克蛋白相关研究进展

1.4.1热休克蛋白的研究历史

1.4.2热休克蛋白的分类

1.4.3热休克蛋白的生物学功能

1.5昆虫病原真菌遗传转化方法研究进展

1.5.1昆虫病原真菌的遗传转化方法

1.5.2选择标记

1.6重组菌株的安全性问题

1.7总结与展望

第二章引言

2.1研究目的意义

2.2主要研究内容

第三章 球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1的cDNA及启动子克隆与分析

第四章 球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1在胁迫条件下的转录表达差异分析

第五章 球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达及功能分析

第六章 球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1重组工程菌株构建及评价

第七章 球孢白僵菌热休克蛋白基因hsp70的cDNA及启动子克隆与分析

第八章 球孢白僵菌热休克蛋白基因hsp70在胁迫条件下的转录表达差异分析

第九章 球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因tps2的cDNA及启动子克隆与分析

9.1材料和方法

9.1.1实验材料

9.1.2实验方法

9.2结果与分析

9.2.1 Bbtps2基因cDNA的特异片段扩增

9.2.2 Bbtps2基因5’-末端与3’-末端克隆

9.2.3 Bbtps2基因cDNA克隆与序列分析

9.2.4 Bbtps2基因编码氨基酸的特征分析和高级结构预测

9.2.5 Bbtps2基因启动子的克隆与分析

9.3讨论

第十章总结

第十一章创新点

参考文献

致谢

个人简介、攻读博士学位期间发表的学术论文及参与的科研项目