安徽牯牛降自然保护区耳霉物种多样性及其疑难种的分子鉴定

摘要

耳霉属不仅在虫霉目乃至菌物的系统学中都占有特殊的重要地位，而且在生态环境中也发挥重要作用。牯牛降自然保护区是我国东部亚热带常绿阔叶林带的重要典型地区之一，保护区内动植物和真菌的种类极其丰富。因此我们对安徽牯牛降自然保护区的耳霉(真菌)物种多样性及其疑难种进行了系统研究。
　　 2010年4月至2012年3月，在安徽省池州市石台县和黄山市祁门县牯牛降自然保护区进行土壤及枯枝落叶样品的采集和分离，并对分离所获耳霉菌株进行形态学鉴定。根据Drechsler和King的分离和鉴定方法，从该地区样品中共分离获得82株耳霉。依据King和Ben-Ze'ev&Kenneth的耳霉形态学分类系统，将这82个菌株鉴定为10个耳霉种，其中包括1个新种，1个新变种和1个新记录种；它们分属于3个亚属，即耳霉亚属中含有：牯牛降耳霉Conidiobolusguniujiangensissp.nov.(新种)(1株)、有味耳霉Conidiobolusosmodes(5株)、近隔接合孢耳霉Conidiobolusiuxtagenitus(2株)、大乳突耳霉Conidiobolusmacropapillatus(3株)；毛管霉亚属含有：异形孢耳霉Conidiobolusheterosporus(12株)，皱孢耳霉Conidiobolusrhysosporus(新记录种)(1株)；德拉霉亚属有：冠耳霉Conidioboluscoronatus(55株)，贝尔弗雷德耳霉Conidiobolusbrefeldianus(1株)、多育耳霉Conidioboluspolytocus(1株)、冠耳霉长柔毛变种Conidioboluscoronatusvar.longvillosusVar.nov.(新变种)(1株)。经调查和研究发现，安徽省牯牛降自然保护区的冠耳霉分布最多，其次是异形孢耳霉。
　　 对所获得的10株耳霉采用CTAB法提取DNA，用引物LROR和LR5对28SrDNA基因的部分区域进行特异性扩增，测序获得1000bp左右的序列。使用软件BIOEDIT和DNAMAN进行序列编辑和比对，以尖突巴科霉Batkoaapiculata和蝇虫霉Entomophthoramuscae为外群，利用PAUP*4.0b10软件的最大简约法对27个耳霉菌株进行系统发育分析。从系统发育树可看出明显3个分支，这3个分支基本符合Ben-Ze'ev&Kenneth在1982提出的3个亚属的划分标准。同时分子证据支持我们10个耳霉种的形态学研究结果。
　　 在对该区域耳霉进行形态学研究时，我们发现一株RCEF5347耳霉菌株和常见的冠耳霉近似，但在柔毛孢子上和原描述有所不同，因此扩增了该菌株和5株来自中国不同地区的冠耳霉的28SrDNA和EF-1α的部分区段序列，将获得序列和NCBI网站下载的冠耳霉序列运用DNAMAN软件比对，统计相似率发现冠耳霉菌株间的28SrDNA为98.4％-99.8％和98.1％-100％；RCEF5347和冠耳霉为96.4％-96.9％和94.6％-95.2％，再结合形态学证据，将RCEF5347确定为冠耳霉的一个变种。