人类精原干细胞体外培养初步研究

摘要

精原干细胞(Spermatogonial stem cells)是男性生殖细胞系中特有的一种干细胞。它不仅能自我复制形成新的精原干细胞，而且还能通过减数分裂的方式分化为终末端细胞精子。因此，精原干细胞对于维持睾丸内干细胞池的稳定和生精过程的持续具有重要的作用。然而，人类精原干细胞的体外培养建系研究却鲜有进展。 目的：本研究是主要目的是探索一种适合人精原干细胞生存和扩增的体外培养体系，为研究生殖干细胞的发育过程建立良好的实验平台。 方法：本实验主要采用不同种类的饲养层细胞和性激素以及细胞因子联合作用构建体外培养体系。从人类胚胎和成熟睾丸组织中分离精原干细胞，接种在不同密度的人成纤维细胞饲养层和小鼠成纤维细胞饲养层上进行培养，筛选出最合适的支持细胞体系。在此基础上，分别添加不同浓度的性激素例如睾酮(Testosterone)和雌激素(Estrogen)以及多种的细胞因子例如干细胞因子(SCF)，胶质细胞营养因子(GDNF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF)及碱性成纤维细胞生长因子加白血病抑制因子(bFGF+LIF)组合以检测其是否对精原干细胞具有促进增殖的作用。在培养过程中，应用5-溴，2’-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)整合实验和原位凋亡检测实验(TUNEIL)筛选出最佳的培养体系。同时，在培养基中加入P13K和MEK信号通路的抑制剂(LY294002，U0126)对有效的影响因子进行阻滞以检测其作用机理。培养得到的细胞克隆应用免疫细胞化学和PCR技术对生殖细胞基因和多能性基因进行检测。 结果：本实验结果表明，密度为1X105/1.39cm2的人成纤维细胞作为饲养层能最大限度的维持细胞不发生凋亡，但对细胞并无促进增殖的能力。我们发现添加SCF能促进人幼稚型精原干细胞克隆的产生，尤其能重新激活已经进入有丝分裂停滞期的幼稚型精原干细胞重新恢复分裂，但其作用时间不超过两周。同时SCF的作用效果具有明显的剂量依赖性和年龄特异性。使用特异性的信号阻断剂LY294002和U0126阻断P13K和MEK通路后能中和SCF的作用并导致幼稚型精原干细胞发生凋亡。幼稚型精原细胞克隆表达特异性生殖细胞抗原DAZL，VASA,MAGE-A4和Plzf以及多能性标记如AKP，Oct-4和SSEA-4等。PCR结果显示幼稚型精原干细胞表达一系列胚胎干细胞的特定基因如Oct-4,Nanog,THY-1，Sox-2和LEFTA等。与幼稚型精原干细胞不同的是，成熟型精原干细胞的增殖非SCF依赖但依靠bFGF和LIF两个因子的联合作用，其作用时间也不超过三周。特异性阻断P13K和MEK信号通路后并不能导致成熟型精原干细胞发生凋亡。成熟型精原干细胞克隆也表达DAZL，VASA，MAGE-A4和Plzf等特异性生殖细胞表标记。与幼稚型精原干细胞一样，成熟型精原干细胞也表达Oct-4和AKP等多能性标记，但不表达SSEA-A4。PCR结果显示成熟型精原干细胞也表达胚胎干细胞特定的多能性基因。 结论：本实验发现SCF能诱导幼稚型精原干细胞克隆形成，而成熟型精原干细胞则依赖bFGF和LIF的刺激才能形成克隆。目前的培养体系不能维持人精原干细胞的体外长期扩增，提示可能还有其他关键细胞因子有待研究。并且，培养得到的克隆表达一系列多能性标记。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：专业名词缩写中英文对照表

声明

前言

实验技术路线图

第一章人幼稚型精原干细胞体外培养和鉴定

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.2主要仪器

1.3实验方法

2结果

2.1饲养层筛选

2.2激素筛选

2.3细胞因子筛选

2.4 SCF作用呈年龄特异性和时间依赖性

2.5 SCF作用呈P13K和MEK信号通路依赖性

2.6细胞因子和性激素受体基因检测

2.7幼稚型精原干细胞克隆的鉴定

3讨论

4结论

附图1

附图2

第二章人成熟型精原干细胞体外培养和鉴定

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.2主要仪器

1.3实验方法

2结果

2.1饲养层筛选

2.2激素筛选

2.3细胞因子筛选

2.4 bFGF和LIF作用呈时间依赖性

2.5 P13K和MEK信号通路阻滞检测

2.6细胞因子和性激素受体基因检测

2.7成熟型精原干细胞鉴定

3讨论

4结论

附图1

附图2

小结

课题的创新点

参考文献

综述u3000精原干细胞的标记与微环境研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的论文