盐角草铜锌超氧化物歧化酶基因(SeCZS)的克隆和耐盐性分析

摘要

世界上土地资源正日益遭受着干旱、风化、土壤盐碱化等的多种胁迫。我国分布有广泛的盐碱地,面积约有0.33亿hm2,还在逐步扩大,盐胁问题越来越严重。土壤中的盐浓度高,对许多的植物造成了不可逆的伤害,抑制植物的生长,甚至造成植物死亡。世界各国在控制和改良盐碱地方面,主要通过灌溉农业、物理化学及生物技术等措施。目前,通过研究植物的耐盐机制,利用生物技术方法克隆耐盐植物的耐盐基因,培育抗盐作物品种,可以有效地解决土壤盐碱化带来的不利影响。盐角草是盐角草属一年生低矮草本植物,生于平原荒漠区湖边潮湿盐土上。它们是典型的耐盐植物,耐盐机制受到越来越多的研究者关注。超氧化物歧化酶(SOD)是机体内可以催化超氧阴离子生成O2和H2O2的金属酶,在生物体内广泛存在,而且可以迅速的清除活性氧。研究发现,SOD在医学、食品保健和化妆品方面都起到重要的作用,应用广泛。SOD可以起到防御损伤的作用,与多种疾病有关,它们与植物的抗逆性方面也是密切相关的。
　　本实验选取的耐盐植物为盐角草,用RACE的方法克隆出盐角草Cu/Zn-SOD基因,使用生物学软件分析核苷酸和氨基酸序列,并进行同源性比对。构建原核表达载体,转化大肠杆菌,使目的蛋白在重组菌中表达,并分析了不同盐浓度并含有抗生素的液体LB培养基中菌的生长情况,IPTG诱导表达,通过测定波长为600的OD值来分析Cu/Zn-SOD基因的耐盐功能。为以后研究盐角草Cu/Zn-SOD基因的应用以及在植物抗逆性作用中的应用奠定基础,如培育耐盐农作物新品种。
　　1.通过简并引物PCR扩增和RACE技术,克隆出盐角草Cu/Zn-SOD基因。盐角草Cu/Zn-SOD基因(GenBank登录号:JQ074238.2)全长为660bp,开放阅读框长为459bp,推测编码152个氨基酸,蛋白分子量约为15.1KDa,其氨基酸序列与碱蓬的序列相似性为96％,与黄灯笼辣椒的序列相似性为88%。生物学软件分析表明Cu/Zn-SOD蛋白可能存在于细胞质。
　　2.根据获得的盐角草Cu/Zn-SOD基因序列设计引物,扩增编码区,并在引物序列上分别加入NotI和BamHI酶切位点。构建原核表达载体pET-Cu/Zn-SOD和对照pETDuet-1,转化大肠杆菌E.coliBL21中。蛋白经IPTG诱导表达。经SDS-PAGE蛋白电泳检测发现表达蛋白条带大小与预期一致,说明目的蛋白成功表达。
　　3.将重组菌接种到含盐浓度为1%、5%、6%、7%的液体LB培养基中培养,10h后每3h,测定一次OD600值。结果发现重组表达菌BL21(pET-Cu/Zn-SOD)表现出了较明显的生长优势,与对照菌相比较,耐盐性提高了约1-3倍,说明盐角草Cu/Zn-SOD基因在植物耐盐方面可能具有一定作用。

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1 文献综述

1.1 盐角草的研究进展

1.2 活性氧的形成和清除

1.3超氧化物歧化酶（SOD）的研究进展

2 引言

3 材料和方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

4 结果与分析

4.1 盐角草总RNA的提取

4.2 SeCZS基因的克隆

4.3 SeCZS基因的生物信息学分析

4.4 盐角草Cu/Zn-SOD蛋白序列的同源性分析

4.5 SeCZS基因的原核诱导表达

4.6 SeCZS基因耐盐性鉴定

5 讨论

6 结论

参考文献

附录

致谢

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