miR-32-5p在小鼠血管平滑肌细胞中对PTEN表达调控的作用及机制研究

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缩略词表

第1章 前 言

第2章 实验材料

2. 1细胞及载体

2.1.1 细胞株及miRNA类似物

2.1.2 细菌株菌

2.1.3 质粒载体

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器

2.4主要试剂的配制

2.4.1 普通培养基配制

2.4.2 PBS

2.4.3 电泳液缓冲液

2.4.4 转移缓冲液

2.4.5 分离胶配方

2.4.6浓缩胶配方

2.4.7 PBST

2.4.8 封闭液

2.4.9 抗体稀释液

2.4.10 10％过硫酸铵

2.4.11 LB培养基的配制

第3章 实验方法

3.1细胞培养

3.1.1细胞换液

3.1.2细胞传代

3.1.3 细胞冻存

3.1.4 细胞复苏

3.2 小鼠血管平滑肌细胞总RNA提取

3.3逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）合成cDNA

3.4 琼脂糖凝胶电泳

3.5.1 细胞转染

3.5.2小鼠血管平滑肌细胞蛋白的提取

3.5.3 蛋白含量的测定—BCA法

3.5.4 蛋白电泳

3.6生物信息学分析

3.6.1 通过miRNAbase在线数据库查询miR-32的成熟序列。

3.6.3 从 GeneBank 中下载并获得靶基因的 mRNA 序列及其所含的3’UTR；3.6.4利用网站在线分析 miR-35 与靶基因的种子序列匹配情况

3.7.双荧光素酶报告基因实验

3.7.1 PTEN野生型荧光素酶报告基因WT-GV272-PTEN 3’UTR的构建

3.7.2 PTEN基因MUT GV272-PTEN 3’UTR的构建

3.7.3 双荧光素酶报告基因的检测

3.8 统计学分析

第4章 实验结果

4.1生物信息学分析结果

4.1.1.成熟miR-32序列

4.1.2 miR-32的靶标预测

4.2 双荧光素酶报告基因载体构建

4.2.1.野生型及突变型PTEN荧光素酶报告基因载体的鉴定

4.2.2 miR-32可直接与PTEN 3’UTR区结合

4.3 miR-32对PTEN mRNA及蛋白表达的影响

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

文献综述:与血管钙化相关的因素

附录

致谢