梅毒螺旋体鞭毛蛋白免疫活性分析及其诱导HaCaT细胞表达基质金属蛋白酶的分子机制

摘要

背景与目的：梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）引起的严重危害人类健康的性传播疾病，其传播途径与艾滋病相同，且可明显增加感染和传播艾滋病的危险性。近年来梅毒发病率跃居我国各类性传播疾病之首，快速准确的诊断对于预防和控制梅毒具有重要意义。迄今为止，Tp的致病机制和致病物质仍不清楚，细菌鞭毛蛋白作为一种经典病原相关分子模式，在促进病原体侵袭和诱导宿主炎症反应中发挥重要作用。角质形成细胞是皮肤屏障中重要的免疫前哨细胞，参与皮肤免疫炎症反应。因此，我们推测：Tp鞭毛蛋白可能通过诱导角质形成细胞表达基质金属蛋白酶，进而降解细胞外基质，引起皮肤免疫炎症反应并促进Tp侵袭。本研究旨在通过原核表达重组Tp鞭毛蛋白，分析其免疫原性和免疫反应性，评价其是否具有候选抗原的价值。同时，以人皮肤角质形成细胞为靶细胞，明确Tp鞭毛蛋白能否通过TLR5激活角质形成细胞表达基质金属蛋白酶，阐明Tp鞭毛蛋白诱导角质形成细胞基质金属蛋白酶的相关信号通路。本研究将为阐明Tp分子致病机制提供新思路和依据，对梅毒防控具有重要现实意义。　　方法：　　1.以Tp Nichols标准株基因组DNA为模板，PCR扩增Tp鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3全基因片段；构建pET28a-FlaB1（FlaB2、FlaB3）原核表达载体；酶切、测序鉴定后，转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中。　　2.IPTG诱导重组鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3表达，Western Blot对表达产物进行分析和鉴定；用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白，BCA法测定蛋白浓度。　　3.以Tp Nichols株，Chicago株和Tp临床分离株（nhgz01和nhgz02）建立梅毒感染动物模型，收集感染兔血清，Western Blot检测重组鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3与感染兔血清和梅毒患者血清的免疫反应性。　　4.重组鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3免疫新西兰兔，收集免疫血清，Western Blot和ELISA法检测重组蛋白的免疫原性和免疫反应性。　　5.建立重组鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3 ELISA方法，检测各期梅毒患者血清、交叉血清及阴性血清中特异性IgG和IgM，初步评价重组蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3在梅毒血清学诊断中的应用价值。　　6.培养人永生化的角质形成细胞（ HaCaT），以10μg/mL FlaB1、FlaB2、FlaB3分别刺激HaCaT细胞48h后，蛋白芯片检测基质金属蛋白酶的表达变化。　　7.以不同浓度0.1、1、10μg/mL FlaB1、FlaB2、FlaB3分别刺激HaCaT细胞24h后，RT-PCR检测MMP-9、MMP-13的mRNA表达水平，明胶酶谱实验和Western Blot检测MMP-9的活性和表达水平，ELISA法检测MMP-13的表达水平。　　8.HaCaT细胞转染2μg TLR5、TLR2、TLR4、MyD88特异性干扰质粒和对照质粒后培养24h，随后用10μg/mL FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激培养48h，Western Blot和ELISA分别检测MMP-9、MMP-13的表达变化。　　9.分别用终浓度为10μg/mL的FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT细胞15min、30min、60min、120min后，Western Blot检测ERK、JNK、p38磷酸化水平。　　10.分别用终浓度为10μg/mL的FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT细胞15min、30min、60min、120min后，Western Blot检测细胞中总IκBα的降解水平，磷酸化IκBα的表达水平。用10μg/mL的FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT细胞2h后，免疫荧光检测NF-κB p65亚基核转位情况。　　11.采用特异性抑制剂ERK(10μM PD98059)、JNK(20μM SP600125)、p38MAPK(10μM SB203580)、NF-κB(10μM BAY117082)预处理HaCaT细胞后，用终浓度为10μg/mL FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT细胞48h，Western Blot和ELISA分别检测MMP-9、MMP-13的表达变化。　　结果：　　1.PCR扩增获得与目的片段大小相符的基因片段：FlaB1（861bp）、FlaB2（861bp）、FlaB3（858bp），重组质粒经测序鉴定与目的基因一致。　　2.IPTG诱导表达出相对分子量约为36kDa(FlaB1)，35kDa(FlaB2)，34kDa(FlaB3)的目的蛋白，经Ni2+-NTA纯化后BCA测定浓度约为2mg/mL。　　3.在新西兰兔感染Tp Nichols标准株，Chicago株及Tp临床分离株(nhgz-01和nhgz-02)后获取的梅毒感染兔血清，以及梅毒患者血清中均检测到FlaB1、FlaB2和FlaB3特异性抗体的表达。　　4.Tp鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3在初次免疫后7天，抗血清中即可检测出鞭毛蛋白的相应IgG抗体，三次免疫后获取的免疫血清效价达到1:51200。　　5.各蛋白IgG ELISA总的敏感性分别为：FlaB1（95.4％）、FlaB2（92.6%）和FlaB3（95.1%），在IgM ELISA中，重组蛋白对一期梅毒和先天梅毒表现了较好的敏感性，其敏感性分别为：FlaB1（76.8%，83.1%）、FlaB2（72.0%，87.7%）和FlaB3（74.4%，89.2%）；IgG ELISA总的特异性分别为：FlaB1（98.9%）、FlaB2（95.8%）和FlaB3（95.8%），在IgM ELISA中，其特异性分别为：FlaB1（96.8%）、FlaB2（97.9%）和FlaB3（95.8%）。　　6.鞭毛蛋白诱导HaCaT表达多种MMPs和TIMP，其中MMP-13，TIMP-1，TIMP-2在三组中表达量均明显升高；仅FlaB1可诱导MMP-9的表达量显著升高。　　7.FlaB1诱导MMP-9 mRNA和蛋白表达呈浓度依赖性，10μg/mL FlaB1可诱导MMP-9 mRNA和蛋白表达水平显著升高。MMP-13 mRNA和蛋白表达水平也呈浓度依赖性，当蛋白浓度达到10μg/mL时，可引起MMP-13 mRNA和蛋白表达水平显著升高。　　8.HaCaT细胞转染TLR5和MyD88干扰质粒后可显著抑制MMP-9、MMP-13的表达，而转染TLR2和TLR4干扰质粒后，MMP-9、MMP-13的表达量无明显改变。　　9.FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT细胞后可诱导ERK、JNK、p38发生不同程度磷酸化且呈一定的时间依赖性。　　10.FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT细胞后，IκBα发生不同程度的降解和磷酸化且呈一定的时间依赖性。FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT细胞2h后，NF-κB p65亚基发生了不同程度的核转位。　　11.HaCaT细胞采用特异性抑制剂处理后，FlaB1诱导MMP-9的表达量被显著抑制，但是p38特异性抑制剂SB203580处理细胞后，MMP-13的表达水平与对照组比较，无显著性差异。　　结论：　　1.梅毒螺旋体鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3具有较强免疫活性，能够诱导机体产生特异性免疫应答，可做为梅毒血清诊断候选抗原。　　2.梅毒螺旋体鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3经TLR5/MyD88依赖途径激活HaCaT细胞表达MMP-9和MMP-13。　　3.MAPK和NF-κB信号通路参与调控梅毒螺旋体鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3诱导HaCaT细胞表达MMP-9和MMP-13。

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前言

第一章 梅毒螺旋体鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3的克隆、表达与纯化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二章 梅毒螺旋体鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3免疫活性分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第三章 梅毒螺旋体鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3诱导HaCaT细胞基质金属蛋白酶表达与调控

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

结论

参考文献

文献综述 ;梅毒实验室诊断研究进展

附录

攻读学位期间的科研成果

致谢