Fs(2)Ket基因对果蝇大脑视叶发育的影响

摘要

果蝇Female sterile(2)Ketel基因编码的核孔运输蛋白β亚基，具有高度保守性，在核孔运输、纺锤体形成与核膜组装及线粒体发生都具有重要作用。被报道的Fs(2)Ket 基因功能丧失影响核孔运输、有丝分裂周期、胚胎卵壳的形成以及线粒体功能以及眼睛成虫盘的发育。我们推测Fs(2)Ket 可能影响果蝇大脑视叶的发育，但至今未有Fs(2)Ket对大脑发育的影响的报道。　　为探究Fs(2)Ket对果蝇大脑发育的影响，我们采用了对Fs(2)Ket缺失实验。使用Gal4-UAS表达系统将Fs(2)Ket 表达沉默，这里使用了在果蝇神经上皮中特异表达的c855a-GAL4与NP7340-GAL4，来驱动表达Fs(2)Ket的RNAi品系，将上皮细胞中Fs(2)Ket 沉默。研究表明，在选择的四个Fs(2)Ket果蝇RNAi品系中，只有一个RNAi品系THU2731对果蝇大脑发育有明显影响。Fs(2)Ket RNAi2731经过c855a-GAL4或NP7340-GAL4驱动表达，果蝇幼虫能够生长到晚三期后化蛹，但会在蛹期致死，并且实验组幼虫到达晚三期的时间较野生型晚，幼虫到达晚三期的时间延迟1~3天不等。由于不同温度下GAL4表达活性不同，蛹期致死的具体时段不同，31℃和25℃致死发生在蛹内，而18℃下的致死发生在蛹后期，即成虫飞出的过程致死。　　考虑到表达强度与实验周期，最终我们采用25℃培养条件下，将Fs(2)Ket RNAi与GAL4杂交结果作为实验组，w1118作为对照组，经不同时期取样（48h ALH、60h ALH、72h ALH、96h ALH）进行免疫组化染色、制片、激光共聚焦成像观察，发现48h ALH时，实验组果蝇大脑视叶中神经上皮细胞与对照组野生型均无明显差异；60h ALH时，实验组与对照组相较，果蝇大脑视叶中神经上皮细胞数量稍少，大脑半球也较小，脑髓神经节较薄；72h ALH时实验组果蝇大脑视叶中神经上皮细胞较对照组神经上皮出现扭曲，细胞形态也开始转化为圆型细胞，并且上皮数目没有对照组多，大脑半球明显小于对照组，脑髓神经节较对照组薄，神经板无明显差异；在96h ALH时，实验组神经上皮细胞大部分解体，转化成圆形细胞形成一个环形的花瓣状，大脑半球明显小于对照组，脑髓神经节较对照组薄并且产生了空缺，未形成新月型的神经板，而是呈弥散分布。实验组在NP7340-GAL4驱动下要比野生型延迟1~3天才达到晚三期。实验组晚三期果蝇大脑OPC中神经上皮细胞大部分缺失或完全缺失，转化为圆形细胞；神经板细胞变得更加弥散；脑髓神经节变薄并有空缺，大脑半球体积稍有变小。这些结果表明，Fs(2)Ket 基因在果蝇大脑视叶发育过程中对OPC神经上皮细胞维持是必要的，其功能的丧失会导致神经板形态及脑髓神经节发育的严重缺陷。

目录

声明

主要符号对照表

第1章 引言

1.1 果蝇中枢神经系统介绍

1.2 果蝇中神经干细胞及胶质细胞

1.2.1 果蝇中神经干细胞分裂方式

1.2.2 果蝇中神经干细胞的分类

1.3 果蝇的视觉系统

1.3.1 果蝇复眼结构

1.3.2 果蝇视叶的发育

1.4 幼虫神经上皮细胞

1.4.1幼虫神经上皮细胞发育过程

1.4.2 神经上皮细胞特点

1.5 Fs(2)Ket基因研究进展

1.5.1 Fs(2)Ket基因介绍

1.5.2 Fs(2)Ket基因的作用

1.5.3 Fs(2)Ket基因研究现状

1.5.4 Fs(2)Ket基因研究目的及意义

第2章 材料与方法

2.1 果蝇玉米粉培养基制作

2.2实验用到的主要试剂

2.2.1 免疫组化中所用到的抗体

2.2.2 常用缓冲液及配方

2.2.3 实验中用到的固定液的配制

2.2.4 实验中其它试剂及配制方法

2.2.5 实验所用主要工具和仪器

2.3 果蝇品系及培养条件

2.3.1 果蝇品系

2.3.2 果蝇培养条件

2.4 实验常用的遗传操作系统

2.4.1 Gal4/UAS过表达系统

2.4.2 FLP/FRT体细胞克隆诱导系统

2.4.3 Flip-out过表达系统

2.4.4 UAS品系的构建

2.5 遗传杂交实验

2.5.1 Gal4/UAS杂交

2.5.2 Flip-out克隆诱导

2.6 免疫组化

第3章 Fs(2)Ket基因在果蝇幼虫视叶发育中的作用

3.1 Fs(2)Ket基因沉默后对大脑视叶发育的影响

3.2 Fs(2)Ket基因沉默在果蝇幼虫神经上皮的动态表达

3.3 Fs(2)Ket基因沉默后对神经上皮有丝分裂速度的影响

3.4 Fs(2)Ket基因沉默后对神经上皮细胞分化的影响

3.5 Fs(2)Ket基因沉默后对神经板和脑髓神经节发育的影响

讨论与展望

讨论

展望

参考文献

致谢