性腺激素对初情大鼠生殖轴上NKB、GnRH和Kisspeptin表达的影响

摘要

初情期启动的早与迟直接影响动物的性成熟和以后的繁殖性能，但其机制仍不清楚。研究表明，在动物初情期发育的调控中，下丘脑促性腺激素释放激素（gonadotropin releasinghormone，GnRH）神经元所分泌的GnRH是初情期启动的决定性因素。一般认为，动物在初情期之前，下丘脑GnRH神经元对性腺类固醇激素的负反馈作用十分敏感，因而在出生后到初情期前这段时间，下丘脑GnRH的分泌因受性腺类固醇激素的作用而一直处于抑制状态，呈现低幅度、低频率的分泌脉冲；初情期的启动始于下丘脑性腺激素抑制机制的解除，但GnRH神经元上并没有性腺激素受体，那么，在性腺激素调节GnRH分泌机制中，应该有对性腺激素敏感的其他中间神经元介导性腺激素对GnRH的调节作用。近期研究发现，神经激肽B（neurokininB，NKB）和Kisspeptin神经元上均有性腺激素受体的表达，二者均能促进GnRH释放和初情期启动。因此，探究动物初情期启动中NKB、Kisspeptin、GnRH和性腺激素受体间的关系尤为重要。
　　目前国内外关于NKB、Kisspeptin和GnRH的研究，多集中于NKB、Kisspeptin和GnRH在不同物种中枢神经系统上的定位和其与初情期的关系的研究，缺少对其在生殖轴上整体的定位研究以及对Kisspeptin、NKB和GnRH与性腺激素水平关系的研究。本试验以皮下埋植性腺激素、卵巢摘除等处理方法，以雌性SD大鼠为研究对象，采用免疫荧光三标技术来观察各个组大鼠生殖轴上NKB、Kisspeptin和GnRH的分布情况，运用Image J和Image-pro plus6.0软件分别计数和测量各组大鼠生殖轴上NKB、Kisspeptin和GnRH的阳性细胞数和平均荧光强度，并分析其间的关系及变化规律。同时结合实时荧光定量PCR、酶联免疫和放射性免疫等分析方法，来阐述NKB、Kisspeptin和GnRH在机体性腺激素水平改变时的变化及其三者间潜在的联系，为进一步研究NKB、Kisspeptin和GnRH在雌性大鼠生殖功能上的作用及其机制提供科学的理论依据。
　　结果显示：（1）E2（29±0.71d）、E2+P4（28±1.53d）、OVX+E2（30±0.38d）、OVX+E2+NKB（28±1.18d）和OVX+E2+P4+NKB（28±0.52d）组大鼠均比Oil（43±1.38d）组大鼠阴门开启的时间显著提前（P<0.01），且这五组间差异不显著（P>0.05）。（2） NKB主要分布于大鼠下丘脑的弓状核、室旁核和腹内侧核，腺垂体以及卵巢的黄体细胞、卵泡膜、颗粒细胞和间质细胞上，且不同部位表达的荧光强度存在差异（P<0.05）。①大鼠弓状核上的免疫荧光强度显著高于室旁核和腹内侧核（P<0.05）。②卵巢摘除组的大鼠弓状核上NKB阳性神经元数显著高于E2和E2+P4组（P<0.05），大鼠室周核上的NKB阳性细胞数目较少（P<0.05），且仅在OVX+E2+P4+NKB、OVX+E2+P4和E2+P4组中分布。③Oil组大鼠下丘脑和腺垂体上的NKB荧光信号显著强于E2、E2+P4、OVX+E2和OVX+E2+P4组（P<0.05）。④大鼠卵巢黄体细胞、卵泡膜和颗粒细胞上的平均荧光强度显著高于间质细胞（P<0.05）。（3）GnRH主要分布于大鼠下丘脑的正中隆起、弓状核和视前区，且以正中隆起处的荧光信号最强（P<0.05）。①E2和E2+P4组大鼠，其下丘脑GnRH的阳性细胞数高于卵巢摘除大鼠（P<0.05）。②大鼠正中隆起处GnRH的平均荧光强度显著高于弓状核和视前区（P<0.05），且同一核团上，E2和E2+P4组大鼠GnRH的平均荧光强度值也较高（P<0.05）。（4）Kisspeptin主要分布于大鼠下丘脑弓状核、室旁核、视前区和室周核。①Kisspeptin的阳性细胞数目以弓状核最高，室旁核和视前区次之，室周核较少（P<0.05）。埋植性腺激素的大鼠室周核上Kisspeptin的阳性细胞数目增多（P<0.05）。（5） OVX+E2、OVX+E2+P4、OVX+Oil、OVX+E2+NKB、OVX+E2+P4+NKB和OVX+Oil+NKB组大鼠下丘脑Tac-2、GnRH、Kiss-1的基因表达量显著高于E2、E2+P4和Oil组（P<0.05）。OVX+E2+NKB、OVX+E2+P4+NKB和OVX+Oil+NKB组大鼠下丘脑ERα的基因表达量显著高于E2、E2+P4和Oil。且ERα与Tac-2和GnRH基因表达呈正相关，而Kiss-1与ERα基因呈负相关。（6）Oil组大鼠血清中NKB的含量显著高于OVX+E2和OVX+Oil组（P<0.05）。OVX+E2+P4+NKB、OVX+E2+NKB和E2+P4组血清中NKB的含量差异不显著（P>0.05）。 E2和OVX+Oil+NKB组大鼠血清中的NKB含量最低（P<0.05）。（7）E2+P4和E2组大鼠外周血液中的雌二醇浓度显著高于其他各组（P<0.05），E2+P4、E2、OVX+E2+P4和Oil组大鼠血液中的孕酮含量最高（P<0.05）。（8）NKB与雌二醇的相关性系数值为-0.81423，呈高度负相关；NKB与孕酮的相关性系数值为-0.478593，呈低度负相关。
　　根据以上结果得出结论：（1）雌二醇和NKB能够诱导大鼠初情期启动时间提前。（2）NKB主要分布在大鼠下丘脑的弓状核、室旁核和腹内侧核，腺垂体以及卵巢的黄体细胞、颗粒细胞、卵泡膜和间质细胞上；Kisspeptin主要分布在大鼠下丘脑的弓状核、室旁核和视前区；GnRH主要分布在大鼠下丘脑的正中隆起、弓状核和视前区。且NKB、Kisspeptin在GnRH分布的关键区域弓状核高度表达，提示NKB、Kisspeptin和GnRH之间存在一定的调控关系，且弓状核是NKB和Kisspeptin调控生殖的关键部位。（3）性腺激素抑制大鼠下丘脑NKB、GnRH和Kisspeptin蛋白及其基因的表达。（4）下丘脑NKB神经元介导ERα对生殖的调控作用。（5）NKB在外周生殖器官卵巢上的广泛分布，说明NKB可能直接调控卵巢的功能。

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文献综述

引言

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂和材料

1.1.2 主要仪器设备

1.1.3 试验所需溶液的配置

1.2 试验动物及处理方法

1.2.1 试验动物分组与处理

1.2.2 E2、P4和Oil缓释硅胶管的制作

1.2.3 皮下埋置缓释硅胶管的方法

1.2.4 双侧卵巢切除术（OVX）

1.2.5 侧脑室注射NKB的操作方法

1.3 试验方法

1.3.1 组织样品的采集与处理

1.3.2 冰冻切片的制作

1.3.3 免疫荧光染色步骤

1.3.4 酶联免疫吸附法检测血清中NKB 的含量

1.3.5 放射性免疫法检测血清中孕酮和雌二醇的含量

1.3.6 荧光定量RT-PCR操作程序

1.3.7数据统计分析

2 结果与分析

2.1 性腺激素处理对大鼠阴门开启的影响

2.2 性腺激素对大鼠生殖轴上NKB、GnRH和Kisspeptin表达的影响

2.2.1 性腺激素对大鼠下丘脑上NKB、GnRH和Kisspeptin定位的影响

2.2.2 性腺激素对大鼠下丘脑NKB、GnRH和Kisspeptin阳性细胞数目和平均荧光强度的影响

2.2.3 性腺激素对大鼠腺垂体上NKB表达的影响

2.2.4 性腺激素对大鼠卵巢上NKB表达的影响

2.3 性腺激素对大鼠下丘脑NKB、GnRH、Kisspeptin和ERαmRNA表达的影响

2.4性腺激素对大鼠外周血液中NKB含量的影响及其相关性分析

3 讨 论

3.1 外源性性腺激素处理对大鼠阴门开启的影响

3.2性腺激素对大鼠下丘脑NKB、Kisspeptin、GnRH表达的影响

3.2.1 NKB、Kisspeptin和GnRH在大鼠下丘脑的分布

3.2.2 性腺激素对大鼠下丘脑NKB、GnRH和Kisspeptin表达量的影响

3.2.3 性腺激素对大鼠下丘脑编码NKB、GnRH、Kisspeptin和Erα的mRNA的影响

3.3 性腺激素对大鼠垂体上NKB表达的影响

3.4 性腺激素对大鼠卵巢上NKB表达的影响

3.5性腺激素对大鼠血液中NKB含量的变化及相关性分析

4 结 论

参考文献

附录

致谢

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