飞虱类虫草共生菌分类地位及共生真菌多样性研究

摘要

长期以刺吸植株韧皮部汁液为食的飞虱，其体内均存在大量共生菌。类酵母共生菌（Yeast-like symbiotes，YLS）是存在于飞虱体内的优势菌群，它们为寄主提供氨基酸、固醇类物质以及蛋白质等多种营养成分，保证飞虱的正常生长和繁殖。已有研究证明，飞虱体内存在多种YLS，其中有一种为类虫草共生菌，但其在真菌中分类地位还未完全确定。本研究运用多基因位点的分子系统发育分析方法，确定了飞虱类虫草共生菌的分类地位。同时，本研究利用对飞虱内生真菌nuc-SSU、nuc-LSU和EF-1α基因克隆和序列比对分析的方法，首次对烟翅白背飞虱Sogatella Kolophon、长绿飞虱Saccharosydne procerus和黑边梅塔飞虱Metadelphax propinqua体内共生真菌的多样性进行了研究。现将主要结果陈述如下：
　　1．通过形态特征的观察，将采集来的宿主飞虱鉴定为7属11种，它们分别是：褐飞虱属的褐飞虱、拟褐飞虱、伪褐飞虱；白背飞虱属的白背飞虱、稗飞虱、烟翅白背飞虱；灰飞虱属的灰飞虱；梅塔飞虱属的黑边梅塔飞虱；长飞虱属的长绿飞虱；白条飞虱属的白条飞虱以及纹翅飞虱属的黑斑纹翅飞虱。
　　2．通过nuc-LSU、nuc-SSU、EF-1α、RPB1、RPB2五基因位点的分子系统发育分析，发现以飞虱为宿主的类虫草共生菌落在线虫草科Ophiocordycipitaceae中线虫草属Ophiocordyceps内，并与O. sphecocephala形成姐妹类群，因此基于多基因位点的证据我们将类虫草共生菌归为线虫草属 Ophiocordyceps。基于nuc-SSU单基因方法对9种飞虱体内的类虫草共生菌进行了进一步的分子鉴定，结果表明这些类虫草共生菌至少存在三个种：（1）褐飞虱线虫草Ophiocordyceps nilaparvata（暂命名），宿主为褐飞虱、拟褐飞虱、伪褐飞虱，菌丝段以长椭圆形为主，并少量存在棒形和洋梨形这两种形态；（2）白背飞虱线虫草Ophiocordyceps sogatella（暂命名），宿主为白背飞虱、稗飞虱、烟翅白背飞虱、黑边梅塔飞虱和白条飞虱，菌丝段主要为椭圆形，长椭圆形较少，并且有类似花生或葫芦的形态；（3）灰飞虱线虫草Ophiocordyceps laodelphax（暂命名），宿主为灰飞虱，菌丝段以椭圆形和扁圆形为主要形态，少量存在洋梨形菌丝段。
　　3．通过EF-1α部分序列的分子系统发育分析，宿主为黑斑纹翅飞虱的类虫草共生菌在类虫草共生菌分类单元中形成一个单系分支，而通过对菌丝段形态特征的比较，发现其与上述三种类虫草共生菌存在着明显的差异。黑斑纹翅飞虱体内类虫草共生菌的形态有椭圆形、长椭圆形、卵形、扁圆形和葫芦形，而葫芦形共生菌大量存在，其数量明显多于其它飞虱。因此基于形态和分子数据宿主为黑斑纹翅飞虱的类虫草共生菌可能为一新种，但需要更多的基因数据支持。
　　4．通过利用nuc-SSU、nuc-LSU和EF-1α三基因位点对烟翅白背飞虱、长绿飞虱和黑边梅塔飞虱共生真菌多样性的研究，结果表明烟翅白背飞虱腹部脂肪体内可能存在类虫草共生菌、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、白地霉（Galactomyces geotrichum）等5种共生真菌；长绿飞虱脂肪体内可能存在一种黑粉菌属真菌、类担子菌酵母属Derxomyces anomala和白地霉（G.geotrichum）等6种共生真菌；黑边梅塔飞虱脂肪体内可能存在8种共生真菌：如类虫草共生菌、真菌病原菌Chamaeleomyces granulomatis、白地霉（G. geotrichum）、Tyrannicordyceps fratricida等。其中发现热带假丝酵母（Candida tropicalis）是烟翅白背飞虱腹部脂肪体内的一种优势共生菌。而长绿飞虱共生真菌的三个基因位点均未检测到类虫草共生菌的序列。另外，在三种飞虱体内均发现了一种与白地霉（耐碱酵母样真菌）相似度为98％以上的共生真菌和一种与变色龙的真菌病原Chamaeleomyces granulomatis相似度为98%的共生真菌，初步断定这两种真菌可能是这三种飞虱体内共同的共生真菌。
　　5．通过显微镜观察，在长绿飞虱体内没有发现类虫草共生菌的存在，分子生物学实验也证实了这一结论。

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1文献综述

1.1飞虱的概述

1.2昆虫内共生菌的研究进展

1.3分子生物学在真菌鉴定与分类中的应用

1.4研究目的与意义

2 引言

3 材料与方法

3.1材料

3.2方法

4 结果与分析

4.1宿主飞虱的鉴定

4.2总DNA的质量检测

4.3 nuc-SSU部分区段扩增和克隆结果

4.4 nuc-LSU部分区段扩增和克隆结果

4.5 EF-1α部分区段扩增和克隆结果

4.6 RPB1部分区段扩增和克隆结果

4.7 RPB2部分区段扩增和克隆结果

4.8飞虱类虫草共生菌的系统发育分析

4.9飞虱共生真菌的多样性分析

5 讨论

6 结论

参考文献

致谢

作者简介

攻读硕士学位期间发表的学术论文