归肝经中药对肝癌HepG2细胞增殖抑制及凋亡诱导作用研究

摘要

肝癌在我国癌症发病率中居第二位，目前对中、晚期及复发性肝癌尚无特效治疗药物。中医药综合治疗因能改善患者临床症状，延长生存期，改善生活质量而倍受关注。近年来中医药抗肝癌研究取得一定成绩，但其机制仍未完全明晰。因此，探索中医药抗肝癌机制,对临床肝癌的治疗，以及筛选高效、低毒的抗肝癌中药有效成分均具有重要的意义。　　 目的：观察归肝经中药对体外HepG2细胞增殖及凋亡的影响，初步探讨归肝经中药抗肝癌作用的趋向性。　　 方法：　　 1. 归肝经中药选取莪术、水蛭、丹参；非归肝经中药选取白花蛇舌草为对照。采用挥发油法提取莪术油，水提醇沉法制备丹参、白花蛇舌草提取物；采用水提醇沉法及液氮快速冻融法提取水蛭提取物。高效液相色谱法鉴定丹参、白花蛇舌草提取物含量，挥发油含量测定莪术油，并对比水蛭提取物的两种制备方法。　　 2.采用MTT法检测归肝经中药莪术、水蛭、丹参提取物对HepG2细胞的增殖抑制作用，以非归肝经中药白花蛇舌草提取物、空白组为对照，根据直线回归方程计算达到半数抑制率（IC50）所对应的提取物药物浓度与生药量，并以IC50对应的提取物药物浓度作为下一步实验的工作浓度。　　 3.采用细胞计数法、流式细胞术检测、吖啶橙荧光染色并分析比较归肝经中药莪术、水蛭、丹参提取物与非归肝经中药白花蛇舌草提取物在IC50药物浓度下对HepG2 细胞生长的影响及诱导凋亡的差异性。　　 结果：　　 1.丹参、白花蛇舌草水提醇沉法提取物的高效液相色谱法鉴定含量分别为丹参酮IIA 0.403mg/g，熊果酸0.212％，挥发油含量测定莪术中莪术醇、莪术酮含量分别为11.70％、5.20％，均符合制备标准。水蛭两种方法制备后经高效液相色谱检测，液氮快速冻融法提取的成分含量要显著高于水提醇沉法。　　 2.MTT法检测结果显示：莪术油IC50药物浓度值为4.992μg/mL，相当于生药1.543mg/mL ； 水蛭提取物IC50 药物浓度值为4.0018mg/mL，相当于生药15.69mg/mL; 丹参提取物的IC5 0药物浓度值为8.007mg/mL，相当于生药22.81mg/mL；白花蛇舌草提取物的IC50药物浓度值为25.04mg/mL，相当于生药259.75mg/mL。白花蛇舌草提取物IC50药物浓度所对应生药量是丹参提取物的11.39 倍，水蛭提取物的16.56 倍，莪术油的168.38 倍。　　 3．IC50药物浓度作用下HepG2细胞生长计数结果显示：24h时，莪术提取物处理后细胞数减少，其他中药提取物生长抑制作用不明显；48h、72h时，归肝经中药莪术、水蛭、丹参提取物抑制HepG2细胞生长作用强于非归肝经中药白花蛇舌草提取物，三种提取物之间作用无明显差异。　　 4.流式细胞术检测结果显示：IC50药物浓度处理24h时，莪术、丹参提取物诱导凋亡作用强于白花蛇舌草、水蛭提取物；处理48h、72h时，归肝经中药莪术、水蛭、丹参提取物诱导HepG2 细胞凋亡率高于非归肝经中药白花蛇舌草提取物，其中48h莪术提取物作用强于丹参、水蛭提取物，72h时莪术、水蛭提取物作用强于丹参提取物。细胞周期检测结果显示水蛭、丹参提取物可阻止HepG2 细胞从G0/G1期进入S期，莪术提取物则使HepG2细胞被阻滞在S期，白花蛇舌草提取物对HepG2细胞周期无明显影响。　　 5．吖啶橙荧光染色：IC50药物浓度处理后，HepG2细胞均可见典型的凋亡细胞形态学改变，归肝经中药提取物明显，而非归肝经中药白花蛇舌草提取物相对较少。　　 结论：　　 1.采用液氮快速冻融提取法制备水蛭提取物优于水提醇沉法。　　 2. 归肝经中药水蛭、莪术、丹参提取物抑制HepG2细胞增殖的IC50药物浓度对应生药量要低于非归肝经中药白花蛇舌草提取物。　　 3. IC50药物浓度作用下，归肝经中药对肝癌HepG2细胞增殖抑制及诱导凋亡作用强于非归肝经中药白花蛇舌草，提示归肝经中药可能具有抗肝癌趋向作用。