腹泻仔猪Salmonella、Escherichia coli分离鉴定及生物膜与耐药性和毒力关系研究

摘要

自2010年冬季以来，先后在我国包括安徽在内的多个省份发生了大范围的生猪腹泻疫情，各种日龄的猪均有发生，其中以哺乳仔猪最为严重，表现为发病急、发病率和死亡率高的特点。根据全国猪病持续监测和调查结果，当前造成生猪腹泻流行的主要病原是猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒，除此之外尚与猪轮状病毒、博卡病毒、猪圆环病毒、沙门氏菌、致病性大肠杆菌等病原的存在有关。沙门氏菌和致病性大肠杆菌是引起仔猪腹泻的主要细菌性病原菌。随着兽医临床上抗生素的不合理使用，致使沙门氏菌、大肠杆菌耐药菌株的数量逐年上升，临床用药效果不明显，而生物膜的形成则是细菌增强抵抗不良环境的结果，如对抗生素的敏感性、毒力的改变等。针对安徽地区的生猪腹泻疫情，为制定有效的防控措施提供科学依据，我们分别从病毒性病原和细菌性病原两个方面展开了调查研究。围绕沙门氏菌和致病性大肠杆菌，本研究进行了以下工作：
　　1、采用常规法结合PCR技术，对601份粪便和肠道内容物样品进行沙门氏菌和致病性大肠杆菌的分离鉴定；并利用玻片凝集试验鉴定分离菌株的血清型。结果显示，601份样品中分离到沙门氏菌69株，阳性检出率为11.5％，致病性大肠杆菌129株，阳性检出率为21.5%。其中粪便样品中沙门氏菌检出率为13.1%，致病性大肠杆菌检出率为7.5%；肠道内容物样品中沙门氏菌检出率为8.8%，致病性大肠杆菌检出率为44.7%。沙门氏菌血清型有德尔卑沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、明斯特沙门氏菌、纽兰沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌，其优势血清型为德尔卑沙门氏菌；致病性大肠杆菌的优势血清型为O:55、O:26、O:125、O:128、O:6、O:111、O:15、O:7、O:104。
　　2、采用Kirby-Bauer纸片扩散法，对沙门氏菌和致病性大肠杆菌分离株进行23种抗生素敏感性实验。结果显示，69株沙门氏菌分离株对四环素和强力霉素的耐药率高，分别为71.1%、69.6%，而对哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、头孢吡肟、头孢哌酮、亚胺培南、头孢曲松均敏感；分离株耐7-10种抗生素的菌株占10.1%(7/69)，耐11种抗生素的菌株占4.3%(3/69)，多重耐药谱为四环素-强力霉素-阿莫西林-氨苄西林-甲氧苄啶-复方新诺明-氟苯尼考。129株致病性大肠杆菌分离株对四环素、氨苄西林、阿莫西林、强力霉素、复方新诺明、甲氧苄啶的耐药率高，分别为92.2%、92.2%、93%、90.7%、89.1%、87.6%，而对亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、呋喃妥因、头孢吡肟的敏感率最高，分别为98.4%、88.4%、88.4%、86.8%。分离株耐2-10种抗生素的菌株占31.0%(40/129)，耐11-20种抗生素的菌株占66.7%(86/129)，耐21种抗生素的菌株占0.8%(1/129)，多重耐药谱为阿莫西林-氨苄西林-四环素-强力霉素-复方新诺明-甲氧苄啶-庆大霉素-环丙沙星。同时结合表型确证试验鉴定产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）菌株，结果鉴定出沙门氏菌1株、致病性大肠杆菌38株。结果表明，沙门氏菌和致病性大肠杆菌均具有较强的多重耐药性，且致病性大肠杆菌强于沙门氏菌。
　　3、采用96孔板法测定沙门氏菌和致病性大肠杆菌分离株体外生物膜形成能力，将生物膜的形成能力分为强（3+）、中（2+）、弱（1+）和阴性（—）。结果显示，沙门氏菌分离株生物膜阳性率为92.8%(64/69)，其中3+占14.5%(10/69)、1+占78.3%(54/69)；致病性大肠杆菌分离株生物膜阳性率为96.1%(124/129)，其中3+占14.7%(19/129)、2+占20.9%(27/129)、1+占60.5%(78/129)。结果表明，沙门氏菌和致病性大肠杆菌分离株生物膜阳性率高，生物膜形成均以1+为主。
　　4、选择生物膜形成强的沙门氏菌3株和致病性大肠杆菌2株，共5株。采用微孔板法测定5株细菌的浮游细菌及生物膜细菌对环丙沙星、氟苯尼考、强力霉素、头孢拉定的最小抑菌浓度（MIC），同时测定不同时间点细菌形成生物膜能力及对应时间点生物膜细菌的MIC。结果显示，5株生物膜细菌对环丙沙星的MIC较浮游细菌提高2~16倍，对氟苯尼考的MIC较浮游细菌提高8~16倍，而对强力霉素和头孢拉定的MIC两者则无差异。5株细菌在不同时间点形成生物膜的能力不同，生物膜形成3+时对环丙沙星、氟苯尼考的MIC最大。结果表明，5株细菌在形成生物膜后对环丙沙星、氟苯尼考的耐药性增强。
　　5、选择8株生物膜形成强3+（3株）、弱1+（3株）、阴性—（2株）的沙门氏菌和8株生物膜形成强3+（2株）、中2+（2株）、弱1+（2株）、阴性—（2株）的致病性大肠杆菌，采用寇氏改良法测定对昆明小鼠的半数致死量（LD50），并利用SAS软件对结果进行分析。结果显示，沙门氏菌生物膜形成3+的LD50分别为2.44×109CFU/mL、8.75×106 CFU/mL、2.80×107 CFU/mL；1+的LD50分别为1.19×107 CFU/mL、1.85×107 CFU/mL、4.77×107 CFU/mL；—的LD50分别为1.50×107 CFU/mL、3.08×107 CFU/mL；致病性大肠杆菌生物膜形成3+的LD50分别为9.59×108 CFU/mL、6.87×108 CFU/mL；2+的LD50分别为2.30×108 CFU/mL、4.64×108 CFU/mL；1+的LD50分别为3.34×107 CFU/mL、7.32×107 CFU/mL；—的LD50分别为1.20×107 CFU/mL、2.75×107 CFU/mL。沙门氏菌生物膜形成3+与1+、—细菌毒力差异显著（P<0.05）；致病性大肠杆菌生物膜形成3+与1+、—细菌毒力差异显著（P<0.05）。结果表明，生物膜形成能力强的细菌较无生物膜细菌的毒力减弱，但易造成临床上持久性的慢性感染。

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文 献 综 述

1 引 言

2 材 料 与 方 法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 数据分析

3 结果与分析

3.1 沙门氏菌和致病性大肠杆菌的分离培养与鉴定

3.2 样品中沙门氏菌和致病性大肠杆菌的检出率情况

3.3 沙门氏菌和致病性大肠杆菌分离株的血清型分布

3.4 沙门氏菌和致病性大肠杆菌分离株生物膜检测结果

3.5 沙门氏菌和致病性大肠杆菌分离株的药物敏感性实验

3.6 分离株毒力测定

4 讨论

4.1 样品中沙门氏菌和致病性大肠杆菌检出情况

4.2 沙门氏菌和致病性大肠杆菌分离株血清型分布

4.3 沙门氏菌和致病性大肠杆菌分离株药物感受性分析

4.4 细菌生物膜与耐药性关系

4.5 细菌生物膜与毒力关系

结论

参考文献

附录

致谢

作 者 简 介

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