人工培育的长座线虫草抗菌活性研究及其化学成分分析

摘要

长座线虫草Ophiocordyceps longissima(Kobayasi) Sung et al.是寄生于同翅目蝉若虫上的一种重要的虫生真菌，其无性型为长座被毛孢。本文对长座线虫草人工培养物的抗菌活性及其化学成分进行了较为系统的研究，主要内容包括：对其无性型菌株RCEF3891进行了液体和固体培养，用4种处理方法对人工培养子实体和液体摇瓶菌丝体进行浸提，采用杯碟法对6种细菌和1种真菌进行抑菌试验，检测浸提物的抑菌活性，选出指示菌，并对抑菌活性高的提取物中的活性组分进行了分离纯化和结构鉴定；同时，测定了人工培养物的部分有效成分并应用LC-MS对甲醇提取物进行了成分分析。
　　抑菌试验结果表明：人工培养长座线虫草子实体和菌丝体的水提物和甲醇提取物对苏云金芽孢杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌有抑菌作用，特别是对后者的抑制作用较为明显。冬虫夏草菌丝体的水提物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌有较弱的抑制作用，对其他供试菌物没有抑制作用。3种人工培养物的乙酸乙酯提取物对供试菌均没有抑菌活性。人工培养长座线虫草子实体和摇瓶菌丝体的提取物在80℃水浴加热后，仍具有抑菌活性，表明其抑菌活性成分有较高的耐热性。
　　实验采用半制备型色谱柱对提取物组分进行初步分离，以抑制白色念珠菌为测定指标对分离组分进行了活性测定，确定出一种活性组分p-1。试验进一步用分析柱分离，成功制备出该活性组分。
　　经LC-TOF-MS和NMR数据解析得知，化合物p-1的分子式为C21H39NO6，系统学名为2S，3R，4R，6E-2-氨基-3，4-二羟基-2-羟甲基l-14-氧-6-二十烯酸，即为多球壳菌素（Myriocin），该化合物在长座线虫草属首次发现且含量较高。
　　对长座线虫草三种人工培养物（子实体、固体平板菌丝体和孢梗束）的部分成分分析结果表明：菌丝体中灰分总量最高，显著高于孢梗束和子实体中灰分的含量。长座线虫草摇瓶菌丝体中氨基酸总量（26.68 g/100g）、必须氨基酸总量最高（7.4g/100g），显著高于孢梗束（22.94、8.03 g/100g）和子实体（20.81、7.97 g/100g）中氨基酸、必须氨基酸的总量。三种人工培养物的麦芽糖含量相当，差异不显著，子实体中海藻糖和葡萄糖含量最高。
　　通过对液体摇瓶菌丝体中多球壳菌素含量的培养优化：确定12~15d为最佳培养时间，通过对五种不同液体培养基的筛选，确定出培养液Ⅴ为最优培养基；进一步对7种碳源和7种氮源的筛选，确定出麸皮和酵母粉为最佳碳源和氮源。
　　对长座线虫草菌丝体和子实体（混有孢梗束）的甲醇提取物成分进行了比较：含有一些共有成分如：多球壳菌素、硬脂酸、鞘氨醇类物质；差异为菌丝体中还含有十八碳二烯酸类、神经碱等物质。除了这些成分外，子实体中的C17H19N5、C22H47NO5、C23H45NO3，菌丝体中的C25H32O8、C21H39NO5这些物质的具体结构和活性尚需进一步研究。

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1文献综述

1.1 虫草中生物活性物质研究概述

1.2 虫草属真菌的药理学作用

1.3 色谱法分离纯化技术

1.4 免疫抑制剂简介

1.5 长座线虫草的研究概况

2 引言

3材料和方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 数据处理

4 结果与分析

4.1 长座线虫草人工培养子实体和摇瓶菌丝体的抑菌活性分析

4.2长座线虫草菌丝体抑菌组分的分离纯化和质谱分析

4.3活性组分的分离及其纯度检测

4.4活性组分的核磁共振图谱解析:

4.5 菌丝体生长和多球壳菌素形成的动力学

4.6 不同发酵液对摇瓶菌丝体多球壳菌素含量的比较

4.7 不同菌株人工培养物中多球壳菌素含量的比较

4.8 RCEF3891菌株几种人工培养物中多球壳菌素含量的比较

4.9 不同碳源、氮源对长座线虫草菌丝体多球壳菌素含量的影响

4.10灰分含量的比较

4.11 海藻糖、麦芽糖、葡萄糖含量的比较

4.12 氨基酸含量的比较

4.13 长座线虫草人工培养物甲醇提取物的成分的比较

5 讨论

5.1长座线虫草的人工培养物

5.2 抑菌试验机理分析

5.3碳源、氮源与多球壳菌素含量的影响分析

5.4 多球壳菌素在菌株间和菌种间差异的讨论

5.5 多球壳菌素含量检测方法讨论

6 结论

参考文献

致谢

个人简介

攻读硕士期间发表的学术论文