两株鹅源鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

摘要

鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎(Duck infectious serositis)，是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一种主要侵害鸭的细菌性传染病，该病发病率、死亡率都很高，严重影响全球养鸭业的经济效益。2013年7月和2014年4月安徽省内两鹅养殖场先后爆发雏鹅急性死亡的病例，患病雏鹅出现拉白色或绿色拉稀、脚掌发黄无血色、头颈扭曲震颤、共济失调等症状，甚至有部分病鹅未表现症状就急性死亡。对病死雏鹅剖检可见心脏、肝脏覆盖纤维素性渗出物，脑膜严重出血。根据临床的表现和剖检所见病理变化初步怀疑为鸭疫里默氏杆菌病。
　　从患病雏鹅的脑部取样进行细菌分离，获得的单个菌落直径约1mm,凸起,湿润,光滑,呈露珠状，镜检为革兰氏染色阴性短小杆菌。通过使用PCR方法扩增分离菌株的16S rRNA后进行测序，序列比对结果显示，两株分离菌株与鸭疫里默氏杆菌同源性为99％，证实引起这两起雏鹅急性死亡疫病的病原菌为RA，分别命名为LAG1株和HFG1株。两株RA分离株的生化特性试验结果一致，二者均为触酶试验结果和脲酶试验结果阳性，不还原硝酸盐，不能液化明胶，多种糖微量反应试验、醇酵解试验、V-P试验、MR试验、吲哚试验结果均为阴性。通过血清凝集试验鉴定这两株鹅源RA均为血清15型。根据RA ompA基因序列的保守区设计引物，建立检测RA的PCR方法，敏感性试验表明所建立的PCR检测方法可检出213ng的RA的DNA。对抗生素的耐药性检测结果表明LAG1株和HFG1株RA对β－内酰胺类药物（d＞18mm），四环素类药物（d＞16mm），大环内酯类药物高度敏感(d＞23mm)；对氯霉素中度敏感(17mm＞d＞13mm)；对氨基糖苷类药物耐药(d＜11mm)。LAG1和HFG1对不良环境的抵抗力略有不同，在酸性条件下HFG1的耐受能力较强，而在碱性条件下LAG1的耐受力较强；在抵抗氧化剂方面H2O2对LAG1和HFG1的最小杀菌浓度（MBC）分别为40mM和20mM；在抵抗洗涤剂TritonX-100对LAG1和HFG1的最小杀菌浓度（MBC）均为0.004%。
　　采用10倍倍比稀释的方法将菌液计数并稀释到含菌量为109、108、107、106、105、104和103CFU/mL的7个稀释度，采用腿部肌肉注射的方法攻毒7日龄樱桃谷鸭，测定LAG1和HFG1的半数致死量（LD50），结果显示：LAG1株的LD50为7.75×103CFU；HFG1株的LD50为5.91×105CFU。将这两株RA分别制备油乳剂灭活苗免疫樱桃谷鸭测定其对血清1型WJ4、血清2型Yb2、血清10型HXb2及原菌株的免疫保护效率，结果显示LAG1株制备的灭活油乳剂疫苗在二次免疫14d后，对原菌株和10型HXb2的攻击可以提供较高的保护，保护率分别可以达到85.7%(6/7)和71.43%(5/7)，对血清1型WJ4、血清2型Yb2攻击的保护率很低均为14.2%(1/7)；。使用HFG1株所制备的灭活油乳剂疫苗对原菌株具有很好的保护率为85.7%(6/7)，对血清10型HXb2的保护力欠佳，为和57.14%(4/7)。对血清1型WJ4无保护力，对血清2型Yb2的保护率仅为14.2%(1/7)。结果对RA疫苗的研制提供一定的指导意义。

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文献综述

1.1病原学

1.2流行病学

1.3耐药相关因子

1.4检测方法

1.5疫苗研究进展

1.6研究展望

1引言

2材料与方法

2.1试验材料

2.2试验方法

3结果

3.1致病菌分离培养特性及形态学观察

3.2生化试验结果

3.3药敏试验结果

3.4 16S rRNA PCR鉴定结果

3.5血清型鉴定

3.6 ompA基因检测方法建立

3.7生长曲线测定

3.8分离菌株耐受性试验结果

3.9分离菌株半数致死量测定结果

3.10交叉免疫保护试验结果

4讨论

4.1安徽省鸭疫里默氏杆菌病的流行病学

4.2鸭疫里默氏杆菌杆菌病的鉴别诊断

4.3 15型RA的耐药性分析

4.4制备弱毒疫苗菌株的初步筛选

结论

参考文献

致谢

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