寡养单胞菌G1菌mpd基因的克隆及甲基对硫磷解酶的性质研究

摘要

本实验室分离筛选出的微嗜酸寡养单胞菌（ Stenotrophomonas acidaminiphila）G1能够降解毒死蜱（CP）、甲基对硫磷（MP）、辛硫磷、二嗪磷、三唑磷（TAP）、丙溴磷。本文将编码甲基对硫磷水解酶（MPH）的mpd基因，克隆到大肠杆菌上并成功表达，然后研究了温度、pH、有机溶剂甲醇等对MPH活性的影响，比较G1菌粗酶液与构建的大肠杆菌工程菌粗酶液对CP、MP、TAP的降解效果。
　　从G1菌中克隆长度为996 bp的mpd基因，构建重组质粒，将该质粒转化到大肠杆菌，获得基因工程菌株，成功表达重组蛋白，重组后的 mpd基因编码的甲基对硫磷水解酶（MPH），经IPTG诱导表达后蛋白约30 KDa，检测其酶活，重组后的蛋白能降解MP。
　　在研究温度对MPH活性影响的时候，研究发现当温度为47℃时，底物MP的降解率最高，说明MPH最适反应温度为47℃。在pH对MP H活性影响的实验中，在碱性条件下，底物MP的降解率均高于在中性条件下，这说明MPH在碱性条件中的活性高，通过实验发现，MPH的最适反应pH为9.1。在研究有机溶剂甲醇对MPH的活性影响实验时，实验结果显示，当添加的甲醇在整个体系的体积比为6％～50%之间时，这可以提高MPH的活性，因为底物MP的降解率明显要高于不加任何甲醇的对照，当添加的甲醇体积比超过50%后，MPH的活性被抑制，底物MP的降解很少，降解率小于不添加甲醇的对照组的降解率。实验结果发现MP的降解产物PNP对MPH的活性没有影响。
　　在G1菌粗酶液与大肠杆菌工程菌粗酶液对两种农药的降解实验中，工程菌粗酶液对C P、TAP的降解率明显高于G1菌粗酶液，这是因为构建的工程菌大肠杆菌能够大量表达MPH。在添加相同的总蛋白量时，G1菌粗酶液对CP的降解率高于对TAP的降解率。将G1菌粗酶液对MP的降解与G1菌对MP的降解结果比较，能够发现 G1菌在经过16代传代后，活力明显下降，克隆的大肠杆菌因其能够大量表达甲基对硫磷水解酶蛋白，所以其对MP的降解率高。在降解实验中，当添加的工程菌总蛋白量相同时，TAP的降解率反而大于MP的降解率，这是因为MP的另一降解产物O,O-二甲基硫代磷酸对MPH有抑制作用。

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术语与缩略语表

1文献综述

1. 1有机磷农药危害

1. 2有机磷农药污染生物修复方法

1.3有机磷农药降解菌

1. 4有机磷农药降解酶的分离纯化

1. 5有机磷农药降解酶及酶制剂的应用

2引言

2. 1研究的目的及意义

2 .2研究的内容

3材料与方法

3. 1实验材料

3. 2生化试剂与仪器

3. 3实验方法

4结果与分析

4. 1 mpd基因克隆结果

4. 24个因子对MPH活性影响的结果与分析

4.3 G1菌粗酶液与工程菌粗酶液对三种农药的降解

5结论

5.1 MPH的最适反应温度为47℃，最适反应pH为9.1

5.2 PNP对MPH的活性没有影响，有机溶剂甲醇在体系中的百分比为6%～50%时有助于提高MP H的活性

5. 3 G1菌粗酶液与工程菌粗酶液对MP、CP、TAP的降解

6讨论

6. 1分离纯化MPH

参考文献

致谢

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