无乳链球菌奶牛乳房炎分离株的生物被膜形成及调控机制研究

摘要

乳房炎是奶牛场的常发病，该病对奶牛场的经济效益有很大影响。无乳链球菌（Streptococcu sagalactiae）是奶牛乳腺炎致病菌之一，又称B群链球菌，革兰氏阳性菌。无乳链球菌的致病性与其产生的毒力因子密切相关，并且毒力因子的种类及数量在不同宿主来源的菌株间存在差异。现普遍认为无乳链球菌的一些毒力因子具有附着和侵袭机体细胞的作用，使菌体易于在奶牛乳腺表面形成生物被膜。细菌形成的生物被膜可以干扰机体的正常免疫功能并引起疾病。中草药含有大量的生物碱、靴质、多糖、挥发油、皂贰以及有机酸类等物质，这些物质具有调节机体免疫系统、直接作用病原物微生物、修复受损组织器官等功效，而且中草药还具有低毒、低残留、不易产生耐药性等特点，所以在治疗细菌生物被膜疾病方面具有广阔的前景。
　　本研究通过对无乳链球菌的生物被膜形成及调控机制研究，为治疗奶牛乳房炎提供了理论依据。
　　1.无乳链球菌最佳成膜条件的摸索
　　为了摸索出无乳链球菌最佳的生物被膜形成条件，本研究使用几种不同培养基对比，结果显示TSB+1％Glucose培养基更适合无乳链球菌形成生物被膜。之后，使用TSB+1%Glucose（加1%牛奶）培养基培养，发现牛奶增强了无乳链球菌生物被膜形成。由此得出，加1%牛奶的TSB+1%Glucose培养基是无乳链球菌最佳成膜培养条件。2.两种中草药水提物和醇提物对无乳链球菌的影响
　　通过对蛇床子和龙葵进行水提取和醇提取，将提取液加入培养无乳链球菌的平板上。发现，龙葵的水提物对无乳链球菌的生长具有抑制作用，而蛇床子的提取物对无乳链球菌生长无影响。
　　3.龙葵水提物对无乳链球菌生物被膜的影响
　　将15mg/mL的龙葵水提物加入TSB+1%Glucose（加1%牛奶）培养基培养下的无乳链球菌菌液中，无乳链球菌无法成膜。在TSB+1%Glucose的培养基中，当龙葵浓度为7.5mg/mL时，无法成膜。
　　4.无乳链球菌生物被膜调控基因的确认
　　查阅文献发现无乳链球菌的生物被膜调控基因为cpsE和neuA，设计实验获取cpsE和neuA的基因序列。
　　5.中草药龙葵水提取物对无乳链球菌生物被膜的调控机制
　　提取加入龙葵水提物的无乳链球菌RNA，反转录和荧光定量PCR。荧光定量PCR结果表明，龙葵水提物抑制了无乳链球菌生物被膜基因cpsE和neuA的基因表达。
　　综上所述，本研究摸索出无乳链球菌的生物被膜形成条件，获取其生物被膜调控基因cpsE和neuA。观察两种中草药对无乳链球菌生长及对生物被膜形成的影响，发现龙葵对无乳链球菌生物被膜的影响最大。通过RT-qPCR，发现龙葵水提物可通过影响cpsE，neuA的表达，进而对无乳链球菌生物被膜产生抑制作用。

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文献综述

1 奶牛乳房炎

2 无乳链球菌

3生物被膜

1引言

1.1 研究目的及意义

1.2 研究内容

1.3 技术路线

2材料和方法

2.1 主要材料

2.2 主要试剂和仪器

2.3研究方法

3结果与分析

3.1 菌株鉴定

3.2 无乳链球菌生物被膜体外成膜最适条件的摸索

3.3 中草药提取物对无乳链球菌的影响

3.4 无乳链球菌生物被膜相关基因的序列测定

3.5 龙葵水提取物对无乳链球菌生长及生物被膜的影响

3.6 无乳链球菌RNA抽提方法的优化

3.7 龙葵水提取物对无乳链球菌生物被膜调控基因的影响

3.8 激光共聚焦显微镜图片

4.讨论

5结论

参考文献

致谢

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