小麦赤霉病菌三个同源CYP51基因表达载体构建和遗传转化

摘要

细胞色素P450甾醇14α脱甲基酶(CYP51)是真菌麦角甾醇合成中的关键酶，也是唑类杀菌剂作用靶标。大部分真菌中含有一个或两个CYP51基因，CYP51A，和CYP51B，而在镰刀菌属真菌中还有第三类CYP51基因，称之为镰刀菌属特异性CYP51C基因。虽然已有研究表明，镰刀菌中三个同源CYP51基因功能不同，CYP51B基因是真菌中最保守的CYP51基因，编码最主要的甾醇14α-脱甲基酶;CYP51A基因则在CYP51B基因缺失或被抑制时，或唑类药剂施用和逆境下大量诱导表达，用于互补CYP51B基因的功能;而CYP51C基因则不再作为甾醇14α-脱甲基酶，而与镰刀菌对寄主小麦致病性及DON毒素合成密切相关。但是目前，关于镰刀菌属中三个CYP51基因的亚细胞定位尚无报道。本研究通过限制性酶切、连接的方法，构建了CYP51C基因的过量表达载体pYGTC和互补融合表达载体pYK11C，构建了RFP融合表达载体质粒pKHR;并通过限制性酶切连接的方法和一步法试剂盒，构建了三个同源CYP51基因，CYP51A、CYP51B和CYP51C基因的GFP融合表达载体pKNTGA-1，pKNTGB和pKNTGC2-1。此外还进行PEG介导的原生质体遗传转化，以敲除转化子△FgCYP51C和△FgCYP51AC，△FgCYP51BC为材料，为探究CYP51C基因功能和CYP51基因亚细胞定位研究提供材料。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 小麦赤霉病的发生与危害

1．1．1 小麦赤霉病的发生流行

1．1．2 小麦赤霉病菌主要毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON毒素)

1．3 表达载体构建方法

1．3．1 传统的载体构建方法

1．3．2 一步克隆法

1．3．3 重组融合PCR法

1．3．4 In-Fusion试剂盒法

1．4 PEG介导的原生质体转化

2 引言

2．1 研究目的及意义

2．2 研究内容

3 材料与方法

3．1 禾谷镰刀菌三个同源CYP51基因的GFP和RFP蛋白融合表达载体构建

3．1．1 供试菌株和质粒

3．1．2 供试培养基

3．1．3 供试引物

3．1．4 RFP骨架载体质粒构建

3．1．5 镰刀菌基因组ONA小量提取

3．1．6 CYP51基因高保真酶扩增

3．1．7 GFP／RFP融合表达载体连接与转化

3．2 CYP51C过量表达载体与互补表达载体构建

3．2．1 供试菌株和质粒

3．2．2 供试培养基

3．2．3 供试引物

3．2．4 DNA提取

3．2．5 CYP51C过量、互补表达载体目的基因片段扩增

3．2．6 CYP51C-O、CYP51C-C表达载体构建连接与转化

3．3 质粒载体的遗传转化

3．3．1 镰刀菌分生孢子的准备

3．3．2 原生质体制备

3．3．3 PEG介导的原生质体转化

3．3．4 转化子筛选

4 结果与分析

4．1 CYP51基因GFP和RFP蛋白融合表达载体构建

4．1．1 GFP／RFP载体骨架改造

4．1．2 GFP、RFP表达载体与CYP51基因双酶切

4．1．3 GFP／RFP融合表达载体构建连接与转化结果

4．2 CYP51C过量、互补表达载体构建

4．2．1 CYP51C-O CYP51C-C与质粒双酶切

4．2．2 CYP51C过量、互补表达载体构建连接与转化结果

4．3 原生质体转化

5 讨论

6 结论

参考文献

附录

致谢

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