基于卵巢RNA组学鉴定影响猪产仔数性状的候选基因及microRNA

摘要

产仔数性状是养猪生产中重要的经济指标，而卵巢作为机体最重要的生殖器官，其较高的排卵数是高产仔数的前提条件。然而猪产仔数性状属于低遗传力性状（约为0.1），所以众多育种学者一直在探究提高猪产仔数的新途径。转录组(RNA-seq)和小RNA测序(microRNA-seq)能针对某一功能状态下特定细胞组织挖掘出所有的基因和miRNA。其中miRNA作为一类重要的非编码小RNA，参与靶基因转录后调控。对二者进行整合分析，能够准确、快速的鉴定筛选出影响猪产仔数的关键基因、miRNA和GO(GeneOntology)条目/KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)通路，深入对猪产仔数分子调控的机理研究。
　　本研究以极端高(YH)、低(YL)产仔数的约克夏母猪为试验对象，进行了如下试验:
　　(1)进行了高、低产约克夏母猪卵巢转录组高通量测序，揭示了卵巢基因表达情况，分析了高、低产母猪卵巢转录组特点，探明了高、低产母猪卵巢基因差异表达情况，对差异表达基因(differentially expressed genes，DEG)进行GO富集和KEGG通路分析，探讨目标DEG潜在的生物学功能;
　　(2)进行了高、低产约克夏母猪卵巢小RNA组高通量测序，揭示了卵巢miRNA表达情况，分析了高、低产母猪卵巢miRNA特征，探明了高、低产母猪卵巢miRNA差异表达情况，对差异表达miRNA(differentially expressed miRNAs，DEM)预测的靶基因进行GO富集和KEGG通路分析，探讨目标DEM潜在的生物学功能;
　　(3)对差异mRNA和miRNA进行互作调控分析，揭示了卵巢DEG和DEM相关性情况，找出影响产仔数的重要节点（基因、miRNA和GO条目/KEGG通路）;
　　(4)定量PCR验证了转录组和小RNA组测序结果，以及mRNA-miRNA相关性分析，并对4个miRNA(miR-126-3p，miR-126-5p，miR-130b和miR-145-5p)进行组织表达谱分析。
　　以上研究主要获得如下结果:
　　(1)高、低产约克夏母猪卵巢文库转录组测序中，分别得到17，485和19，178个基因，其中402个基因仅在YH组中表达，2095个基因仅在YL组中表达，17083个基因在两文库中都有表达。差异分析发现，1243个基因在两组中差异表达，其中897个基因在YH组中上调表达，346个基因下调表达。对1243个DEG进行筛选分析，找出11个候选基因（CO1，GPX3，MSMB，COX3，TIMP1，CYTB，STAR， HSD3B，CYP11A1，SCARB1和HSD17B2）与猪繁殖力和产仔数相关。对1243个DEG进行GO富集和KEGG通路分析，发现类固醇生物合成(Steroid biosynthesis)和卵巢类固醇(Ovarian steroidogenesis)2个通路可能在猪产仔数调控过程中扮演重要角色;
　　(2)对高、低产约克夏母猪卵巢文库miRNA-seq，分别YH组得到327个miRNA，YL组得到320个miRNA，其中30个miRNA只在YH组表达，23个miRNA只在YL组表达，297在两文库中都有表达。差异分析发现，37个miRNA在两组中差异表达，其中21个miRNA在YH组上调，16个miRNA在YH组下调表达。两文库组分别预测到19，628和19，250个靶基因。对37个DEM进行鉴定分析，找出8个DEM(miR-26a，miR-129a-5p，miR-224，miR-99a，let-7c，miR-181c, miR-214 and miR-21)可能影响到猪产仔数。对DEM的靶基因进行进行GO富集和KEGG通路分析，发现显著富集到过氧化物酶体(Peroxisome)等通路上;
　　(3)对mRNA-miRNA进行整合分析，其中up mRNA-down miRNA进行蛋白质互作(Protein-Protein Interaction，PPI)分析获得39个DEG和10个DEM，并富集到10个GO条目/KEGG通路中;down mRNA-up miRNA进行PPI分析获得30个DEG和15个DEM，并富集到10个GO条目/KEGG通路中。其中miR-26a靶向DHCR24基因富集到Steroid biosynthesis通路;miR-129a-5p靶向IGF1基因富集到Ras signaling pathway通路，这些重要节点可能在猪产仔数性状中发挥重要作用。

目录

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论文说明

摘要

图目录

表目录

英文缩略词表

第一章 文献综述

1 猪繁殖力性状的研究进展

1．1 排卵数

1．2 黄体数

1．3 总产仔数、产活仔数和死胎数

1．4 其它(乳头数等)

2 动物卵巢生殖调控功能研究进展

2．1 卵泡发育

2．2 卵巢激素分泌调控

3 猪高繁殖力相关基因的研究进展

3．1 已鉴定的猪繁殖力主效基因

3．2 基于组学技术的猪繁殖力基因筛选

4 猪繁殖力性状相关miRNA的研究进展

4．1 已鉴定的猪繁殖力相关miRNA

4．2 基于组学技术的猪繁殖力miRNA筛选

5 多组学整合分析在动物遗传育种中的应用

5．1 mRNA-miRNA整合分析研究

5．2 其它整合分析

6 研究目的与意义

第二章 基于RNA-seq鉴定影响猪产仔数的候选基因

引言

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 主要仪器、试剂和软件

1．3 总RNA提取

1．4 总RNA质量检测

1．5 cDNA文库构建与高通量测序

1．6 测序结果初步处理

1．7 参考序列比对分析

1．8 基因表达水平分析

1．9 GO富集及KEGG通路分析

2 结果与分析

2．1 测序数据概况

2．2 高、低产组差异基因表达情况

2．3 差异表达基因的功能分析

2．4 产仔数候选基因的鉴定

3 讨论

4 小结

第三章 基于miRNA-seq鉴定影响猪产仔数的microRNA

引言

1 材料与方法

1．1 总RNA提取

1．2 总RNA质量检测

1．3 小RNA测序文库构建与高通量测序

1．4 测序结果初步处理

1．5 参考序列比对及新miRNA的预测

1．6 小RNA分类注释统计

1．7 miRNA表达及差异分析

1．8 miRNA靶基因预测

1．9 靶基因的GO富集和KEGG通路分析

2 结果与分析

2．1 测序数据概述

2．2 序列长度分布

2．3 小RNA文库的分类注释

2．4 高、低产大白猪卵巢miRNA的差异表达概况

2．5 miRNA靶基因预测

2．6 靶基因的GO富集和KEGG通路分析

3 讨论

4 小结

第四章 整合分析鉴定影响猪产仔数性状的候选基因和microRNA

引言

1 材料与方法

1．1 分析平台

1．2 分析软件

1．3 分析方法

2 结果与分析

2．1 差异表达基因与差异表达miRNA分析

2．2 靶基因GO富集和KEGG通路分析

2．3 mRNA-miRNA调控网络分析

3 讨论

3．1 Up mRNA-down miRNA关联分析中的重要节点

3．2 Down mRNA-up miRNA关联分析中的重要节点

4 小结

第五章 RNA-seq和miRNA-seq定量PCR验证及组织表达谱分析

引言

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 主要仪器、试剂和软件

1．3 目标mRNA和miRNA选择及引物设计

1．4 总RNA提取和检测

1．5 cDNA合成

1．6 定量PCR检测

1．7 基因(miRNA)定量数据分析

2 结果与分析

2．1 总RNA质量

2．2 熔解曲线分析

2．3 RNA-seq和miRNA-seq定量PCR验证

2．4 miRNA组织表达谱分析

3 讨论

3．1 RNA-seq和miRNA-seq结果的定量PCR验证

3．2 猪miRNA组织表达特异性与差异性

4 小结

第六章 结论与展望

1 主要结论

2 创新点

3 研究展望

参考文献

附录

致谢

个人简介