家蚕中一种新的磷酸吡哆醛水解酶的初步研究

摘要

维生素B6（VitaminB6,VB6）是自然界中广泛存在的一类吡啶化合物总称，包括吡哆醛（pyridoxal，PL）、吡哆醇（Pyridoxine，PN）、吡哆胺（pyridoxamine，PM）、磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5′-phosphate，PLP）、磷酸吡哆醇（Pyridoxine-5′-phosphate，PNP）、磷酸吡哆胺（Pyridoxine-5′-phosphate，PMP）。它们可以相互转化，但PLP是其主要辅酶形式。PLP主要生理功能是参与生物体内氨基酸的代谢。PLP的结构中有一个性质活泼的醛基，极易与生物体内其它含胺基的化合物结合形成醛亚胺等物质，这可能会扰乱生物体内正常物质水平。细胞中PLP的平衡供给是维持生物健康的关键。
　　PLP代谢在哺乳动物体内研究较多，但是对其如何保持动态平衡的研究还不明确。PLP的调控因素涉及到PLP磷酸酶，PLK，PNPO，蛋白结合程度和传输机制。PLP的水解是控制细胞内游离PLP水平的一个重要机制。相关水解酶基因的克隆是开展这些研究的基础。本实验以模式生物家蚕为材料，由于其特殊的变态生理，其体内氨基酸代谢异常活跃，维持体内PLP浓度的动态平衡的需求在家蚕中更突出。研究家蚕维生素B6的代谢对了解人及其他生物的生理代谢具有重要的参考作用。
　　本研究利用分子生物学技术，用人的特异性PLP磷酸酶氨基酸序列对家蚕进行跨物种搜索获得相似性较高的序列，在家蚕体内克隆得到相关基因（命名为BmPLPP)，该基因ORF序列长1032bp，共编码343个氨基酸，蛋白分子量为37.9 KD，等电点为8.83，属非分泌蛋白。预测显示家蚕蛋白含有水解酶功能域，与人类特异性PLP磷酸酶同属于HAD（卤代酸脱卤酶）蛋白超家族。多序列比对结果显示，BmPLPP和家蚕中已知的碱性磷酸酶的基因和蛋白序列明显不同，酶学性质相差明显，认为不是其同工酶。
　　本研究构建了测序正确的原核表达载体pET24b（+）-BmPLPP重组质粒，转化到Ecoli BL21（DE3）中进行原核诱导表达，并优化了表达条件。SDS-PAGE结果显示在上清中获得到了可溶性目的蛋白。对酶进行Ni-NTA亲和层析分离纯化目的蛋白，采用紫外分光光度计法分析了酶的活性，并对酶学性质研究认为其为磷为一个新的酸酶，可以水解PLP。该酶的以PLP为底物最适反应pH为7.5，在pH7-7.5酶活性较高且稳定。最适反应温度为50℃，但在高温下不稳定，而在30℃~40℃较稳定。本实验的酶需要Mg2+激活催化作用，且随着镁离子浓度升高，催化作用增强；Zn2+对酶活性产生轻微抑制；而Mn2+、Ca2+、Cu2+、EDTA对酶活性有强烈的抑制作用，随着浓度升高，抑制作用增强，Mg2+可缓解EDTA的部分抑制作用。
　　最适条件下，以磷酸吡哆醛（PLP）和磷酸吡哆胺（PMP）为底物的Km值分别为0.368mmol/L和0.404 mmol/L，Vmax分别为0.907 umol/min/ug protein和0.394 umol/min/ug protein。这表明该酶对PLP比PMP具有更好的亲和力。对不同底物催化活性测定，发现该酶对其他磷酸酯底物也有一定活性，但是对PLP活性最大。

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1. 文献综述

1.1. 维生素B6简介其在生物体内作用

1.2. 生物体内维生素B6合成与代谢

1.3. 磷酸酶论述

2. 引言

2.1. 研究背景与意义

2.2. 研究内容

3. 材料与方法

3.1. 实验材料、主要试剂及设备

3.2. 实验方法

4. 结果与分析

4.1. BmPLPP cDNA序列分析预测

4.2. RNA检测结果

4.3. 家蚕BmPLPP基因的克隆和测序分析

4.4. BmPLPP 基因结构和蛋白功能域分析

4.5. 家蚕BmPLPP的序列分析和同源性比较

4.6. 家蚕BmPLPP的原核表达和纯化

4.7. 蛋白浓度

4.8. 酶的部分性质研究

5. 讨论

5.1. 家蚕BmPLPP基因序列分析与蛋白分析

5.2. 水解酶的最适pH 和最适温度

5.3. 金属离子对酶活性的影响

5.4. Km 测定和特异性分析

6. 结论

6.1. BmPLPP基因的克隆、序列分析

6.2. BmPLPP基因原核表达分析

6.3. 酶学性质

6.4. 酶反应动力学常数测定和底物特异性

参考文献

致谢

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