杨树VQ基因家族的表达分析及杨树新内参基因的筛选

摘要

杨树作为重要的造林绿化速生树种和生物能源树种，其生长受到干旱、盐碱等非生物胁迫的制约。因此，研究杨树抵抗逆境胁迫的调控机理，将对防御杨树受逆境刺激起着关键的指导作用。VQ基因家族是植物体内的高度保守的一种蛋白家族，参与植物干旱、盐碱等逆境的调控，这对于提高杨树抗逆性有着十分重要的研究价值。挑选一个适合的内参基因是提高实时荧光定量PCR实验数据真实性，减小实验误差的有效方法，而到目前为止仍未发现一个适宜多个实验条件的内参基因。
　　目前，拟南芥、水稻、葡萄等物种中的VQ基因已经被证明参与它们各自的生长发育及胁迫调控，然而关于杨树中的VQ基因仍未有报道。因此，在本研究当中对杨树的VQ基因进行了综合分析，包括全基因组的鉴定、特征分析和杨树的VQ基因在盐和干旱条件下的表达分析。
　　在杨树新内参基因的研究当中，首先，利用基因芯片技术筛选出6个新内参基因(PtRG1，PtRG2，PtRG3，PtRG4，PtRG5，PtRG6)，并与6个传统内参基因（PtUKN1，PtUBQ，Actin，EF1α，18S rRNA，TUA8)同时进行荧光定量实时荧光定量PCR实验，再利用geNorm，NormFinder和BestKeeper软件对实验的数据进行分析，以比较这12个基因的表达稳定性，从而筛选到合适的内参基因。为进一步验证筛选得到的新内参基因的稳定性，选择杨树VQ基因家族中表达量较高的PtVQ6，PtVQ13，PtVQ37作为目的基因再次进行荧光定量PCR实验。以下是研究的结果:
　　(1)共鉴定出了51个杨树VQ基因，它们可被划分为7个亚家族，这些基因分布在杨树19条染色体中的17条上。
　　(2)杨树VQ基因主要VQ基因主要通过片段复制进行基因扩增。
　　(3)从基因结构和蛋白基序的分析中可以发现，每个亚家族中的VQ基因都是相对保守的，且有39个VQ基因没有内含子。
　　(4)实时荧光定量PCR实验结果表明，VQ基因在不同的胁迫下表达量不同。
　　(5)本研究筛选了6个稳定表达的新内参基因PtRG1-6。
　　(6)研究发现，在盐胁迫和干旱胁迫下，PtRG1，PtRG3和PtRG5的稳定性较好。

目录

声明

致谢

摘要

文献综述

引言

1、杨树VQ基因的研究意义

2、杨树新内参基因的研究意义

1 材料与方法

1．1 实验材料与仪器设备

1．1．1 植株

1．1．2 仪器设备

1．1．3 酶与试剂

1．1．4 主要试剂的配制

1．1．5 实验材料的处理

1．2 杨树VQ基因的研究

1．2．1 杨树VQ基因的鉴定及命名

1．2．2 综合进化树的构建

1．2．3 杨树VQ基因的结构分析

1．2．4 杨树VQ基因的染色体定位和基因复制

1．2．5 旁系同源对与直系同源对的鉴定

1．2．6 复制时间的计算和选择压力的分析

1．4 杨树新内参基因的研究

1．4．1 数据收集

1．4．2 引物设计

1．4．3 实时荧光定量PCR分析

1．4．4 数据整理与分析

1．5 实验操作

1．5．1 植物材料处理

1．5．2 杨树组培苗叶片总RNA的提取

1．5．3 反转录

1．5．5 qRT-PCR反应

2 结果与分析

2．1 杨树VQ基因家族的表达分析

2．1．1 杨树VQ基因的鉴定与命名

2．1．2 VQ基因的综合进化分析

2．1．3 杨树VQ基因的结构分析

2．1．4 杨树VQ基因染色体定位和基因复制

2．1．5 杨树VQ基因在盐和干旱胁迫下的表达模式分析

2．2 杨树新内参基因的筛选

2．2．1 RNA的质量评价

2．2．2 引物特异性验证

2．2．3 盐和干旱胁迫下内参基因稳定性分析

3 讨论

3．1 杨树VQ基因家族的表达分析

3．2 杨树新内参基因的筛选

4 结论

参考文献

作者简介

硕士期间发表论文

附录