森林草莓锌指蛋白ZFP介导SVBV P6蛋白泛素化的机制研究

摘要

病毒致病因子与寄主因子的互作对病毒致病性的影响一直是病毒分子生物学的一个研究热点。SVBV P6蛋白是一个RNA沉默抑制子和症状决定子，与病毒的致病性紧密相关。但迄今为止，尚未见到SVBV P6蛋白与森林草莓蛋白互作的研究报道。本研究以SVBV P6为诱饵蛋白筛选感染SVBV森林草莓的酵母cDNA文库，获得与其互作的寄主因子锌指蛋白ZFP。酵母双杂交、双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)试验方法验证了P6蛋白和ZFP蛋白在体外和体内互作;ZFP蛋白能够影响P6蛋白在植物体内聚集、表达以及减轻P6蛋白介导PVX在本氏烟上的症状表型;蛋白酶体抑制剂MG132能够抑制ZFP介导P6蛋白的降解。本研究的开展对揭示SVBV P6蛋白与草莓锌指蛋白ZFP互作分子机制以及寄主植物和双链DNA病毒之间防御和反防御机理奠定了理论基础。
　　1.P6蛋白与ZFP蛋白互作验证
　　酵母双杂交验证P6与ZFP互作将pGAD-ZFP+pGBK-P6及pGAD-P6+pGBK-ZFP分别共转化酵母，结果发现，共转化的酵母菌均能够在选择培养基平板上生长，说明P6能够与ZFP互作。
　　BiFC验证P6蛋白与ZFP蛋白互作含pCV-nYFP-P6+pCV-cYFP-ZFP和pCV-nYFP-ZFP+pCV-cYFP-P6的农杆菌分别共浸润本氏烟，结果发现，有完整的细胞出现黄色荧光，确认了P6蛋白能与ZFP蛋白在植物体内互作。
　　Co-IP验证P6与ZFP互作含pCM1307-myc-P6+pCM1307-ZFP-flag的农杆菌共浸润本氏烟，Co-IP实验后，western blot能够检测到ZFP蛋白和P6蛋白，说明P6蛋白与ZFP蛋白在植物体内互作。
　　2.森林草莓锌指蛋白ZFP基因的序列比较及分子进化分析
　　将本研究获得的森林草莓ZFP基因与GenBank已登录的其他植物的ZFP基因进行核甘酸序列相似性比较，结果发现，森林草莓锌指蛋白ZFP的核苷酸序列与同属蔷薇科的梅花（P.mume）、白梨（P.bretschneideri）和苹果(M.domestica)的序列相似性较高，为88.6％-88.8％，与其他植物ZFP基因序列的相似性较低，为76.7％-84.6％。
　　构建森林草莓ZFP基因和其他植物ZFP基因系统发育进化树，结果表明森林草莓ZFP基因与同属蔷薇科植物的梅花(P.mume)、白梨（P.bretschneideri）和苹果（M.domestica）ZFP基因单独聚为一个分支，表明森林草莓ZFP基因与蔷薇科植物ZFP基因的亲缘关系最近。
　　3.锌指蛋白ZFP基因在SVBV感染的森林草莓中的差异表达
　　SVBV侵染性克隆接种森林草莓25天后，qPCR分析接毒草莓和接种空菌株草莓中ZFP基因的表达差异，结果表明SVBV能够诱导ZFP表达上调。
　　4.锌指蛋白ZFP亚细胞定位及其与P6蛋白共定位鉴定
　　含质粒pCM2300-P6-GFP和pCM2300-ZFP-mCherry的农杆菌共浸润本氏烟，结果表明，ZFP蛋白能够定位于细胞质、细胞核和细胞边界，DAPI染色发现，P6蛋白能够与ZFP蛋白共定位于细胞核和细胞边界。
　　5.森林草莓锌指蛋白ZFP介导P6在植物体内泛素化降解研究
　　ZFP蛋白能够影响P6蛋白聚集将含有pCAM2300-P6-GFP与pCM1307-ZFP-3*flag及pCAM2300-P6-GFP与空载体的农杆菌共浸润本氏烟，激光共聚焦观察P6蛋白在植物体内聚集情况。结果表明，P6蛋白与ZFP蛋白共浸润时，P6蛋白形成的聚集体明显变小，且聚集的数量变少，说明ZFP蛋白能够影响P6蛋白在植物体内的聚集。
　　森林草莓ZFP蛋白影响P6蛋白在植物体内表达将含有pCM1307-ZFP-3*flag与pCAM2300-P6-GFP的农杆菌浸润本氏烟，紫外灯下观察pCAM2300-P6-GFP的亮度，结果发现P6蛋白与ZFP蛋白共浸润之后，GFP荧光亮度比pCAM2300-P6-GFP与空载体共浸润的亮度要低，说明ZFP蛋白在植物能够干扰P6-GFP的表达;提取浸润区蛋白进行检测，结果发现GFP蛋白表达水平出现明显降低，进一步检测GFP的mRNA水平发现，GFP mRNA的表达水平没有降低。
　　半体内实验检测26S蛋白酶体抑制剂MG132对P6蛋白降解的抑制作用将含有pCAM2300-P6-GFP与pCM1307-ZFP-3*flag质粒的农杆菌共浸润本氏烟，anti-GFP抗体进行Western blot分析。与对照DMSO处理的样品相比，MG132处理的P6蛋白降解速率变慢，说明26S蛋白酶体抑制剂MG132能抑制P6蛋白的降解，表明P6蛋白通过26S蛋白酶体途径降解。
　　体内验证蛋白酶体抑制剂能抑制ZFP介导P6蛋白降解将含有pCAM2300-P6-GFP与pCM1307-ZFP-3*flag质粒的农杆菌共浸润本氏烟，100uM的MG132和100uM的CHX（放线菌酮）一起注射已注射过P6和ZFP共浸润的叶片中，Western blot检测P6蛋白的表达量，结果表明MG132能够抑制由ZFP蛋白介导P6蛋白的降解。
　　6.森林草莓ZFP蛋白影响P6蛋白介导PVX在本氏烟上的症状表型
　　将含有pGR106-ZFP、pGR106-P6和pGR106表达载体的农杆菌注射本氏烟，10天后比较分析症状差异，结果发现，当pGR106-P6与pGR106空载体共浸润时，产生的症状与P6蛋白所表现的症状无明显差异，而当pGR106-ZFP与pGR106-P6共浸润时，植株表现出的症状比单独P6蛋白产生的症状微弱，说明ZFP蛋白能够减弱P6蛋白介导PVX在本氏烟上的症状。

目录

声明

致谢

摘要

文献综述

1 草莓镶脉病毒基本特征及其编码的P6蛋白的功能

1．1 草莓镶脉病毒基本特征、分布及危害

1．2 草莓镶脉病毒的分类及基因组编码的蛋白

1．3 P6蛋白在CaMV各ORF翻译过程中的作用

2 植物病毒致病因子与寄主因子的互作

3 植物锌指蛋白的生物学特性及功能

3．1 锌指蛋白的结构和性质

3．2 锌指蛋白ZFP对植物生长发育的影响

3．3 锌指蛋白的抗逆作用

3．4 锌指蛋白的抗菌作用

3．5 锌指蛋白的抗病毒作用

3．6 锌指蛋白能与病毒蛋白互作

4．1 泛素／26S蛋白酶体降解系统

4．2 UPS的组成

4．3 26S蛋白酶体

4．4 泛素／26S蛋白酶降解系统对植物-病原物互作的响应

引言

材料与方法

1 供试材料

1．1 病样来源

1．2 植物材料

1．3 菌种载体、质粒

1．4 酶和化学试剂

1．6 实验仪器设备

2 试验方法

2．1 草莓总DNA提取

2．2 植物总RNA提取

2．3 PCR产物纯化、回收和连接载体

2．4 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．5 连接产物转化大肠杆菌

2．6 阳性克隆的PCR鉴定

2．7 质粒提取及质粒鉴定

2．8 农杆菌瞬时浸润

2．9 载体构建

2．10 酵母双杂交实验(Yeast two-hybrid system，Y2H)

2．11 BIFC实验(Bimolecular fluorescence complementation，BiFC)

2．12 DAPI染色实验

2．13 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)

2．14 qRT-PCR实验

2．15 载体构建

结果与分析

1 SVBV P6蛋白与森林草莓锌指蛋白ZFP互作鉴定

1．1 酵母双杂交(Y2H)验证P6蛋白与ZFP蛋白互作

2．2 双分子荧光互补验证(BiFC)P6与ZFP在植物体内互作

2．3 免疫共沉淀实验(Co-IP)验证P6与ZFP在植物体内互作

2 森林草莓锌指蛋白ZFP基因的序列比较及分子进化分析

2．1 森林草莓锌指蛋白ZFP核苷酸序列与其他植物锌指蛋白相似性比较

2．1 森林草莓锌指蛋白ZFP基因系统进化树分析

3 锌指蛋白ZFP基因在SVBV感染的森林草莓中的差异表达

4 锌指蛋白ZFP亚细胞定位及其与P6蛋白共定位鉴定

5 森林草莓锌指蛋白ZFP介导P6在植物体内泛素化降解研究

5．1 ZFP蛋白能够影响P6蛋白聚集

5．2 森林草莓ZFP蛋白影响P6蛋白在植物体内表达

5．3 半体内实验检测26S蛋白酶体抑制剂MG132对P6蛋白降解的抑制作用

5．4 体内验证蛋白酶体抑制剂能抑制ZFP介导P6蛋白降解

6 植物ZFP蛋白对P6蛋白介导PVX在本氏烟上症状表型的的影响

讨论

结论

参考文献

作者简介