不同逆境土壤油菜富集分离筛选促生抗病抗逆根际微生物的研究

摘要

利用油菜作为细菌定植的宿主，循环富集不同逆境环境植物根际的微生物，分别从湖北大冶重金属污染土壤、江西湖口有机污染土壤、湖北荆门石油污染土壤和江苏启东盐碱土分离到110，139，141和228株细菌菌株。　　 体外抑制油菜菌核菌实验表明各种土壤分离的细菌，分别有15.5％，15.1％，36.2％，24.6％的细菌具有抑制油菜核盘菌生长的能力。随机挑选了414株细菌，做产生1-氨基环丙酮羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）脱氨酶鉴定，约有18％的细菌含有ACC脱氨酶。　　 挑取12株具有很强的抑制油菜核盘菌的细菌，其中5株含有ACC脱氨酶，检测其ACC脱氨酶活性。对12株细菌进行16s rDNA测序，构建系统进化树，鉴定菌属。并检测抗生素合成基因，以及测序构建进化树，确定细菌种类。研究发现主要是假单胞菌（Pseudomonas sp.），芽胞杆菌（Bacillus sp.）和氧化烃微杆菌（Micobacterium hydrocarbonoxydans）三类细菌。发现5株含ACC脱氨酶分别是P.brassicacearum TY1205,P.brassicacearumTY1210和P.brassicacearum KY5404,以及P.fluorescens TY3101，KY3201。P.protegens KY1502和TY1508具有2，4-二乙酰基间苯三酚(2，4-DAPG)合成关键基因phlD和藤黄绿脓菌素(Plt)合成关键基因pltC。这些细菌与模式菌株Pseudomonas protegens Pf-5和Pseudomonasbrassicacearum Q8r1-96在基因水平上非常相似。　　 根延长实验中所有P.brassicacearum和两个P.protegens KY1502和TY1508都能很好地促进生长。结合5株ACC脱氨酶细菌的重金属最小抑菌浓度和盐最小抑菌浓度实验，以及所有细菌解磷实验，显示ACC脱氨酶细菌具有较强的逆境耐受能力和逆境条件下促进植物生长的潜力。解磷实验结果显示，逆境来源的细菌都具有较好解磷效果，这些细菌在逆境土壤中对改善土壤肥力，促进逆境植物对磷的有效吸收具有潜力。挑选出的6株促进生长性能和体外抑制油菜核盘菌的细菌，进行温室生物防治实验。最后确定P.brassicacearum KY5404具有稳定的抑制油菜菌核病的能力，同样前面的实验证明了其显著的促进油菜生长，还具有ACC脱氨酶活性，可用于生物防治研究。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 文献综述

1．1 油菜菌核病危害及生物防治进展

1．1．1 油菜核盘菌：历史、宿主范围、分布及危害

1．1．2 油菜核盘菌的生物防治研究进展

1．2 土壤污染和土壤环境胁迫以及逆境耐受

1．2．1 重金属污染和胁迫以及耐受作用

1．2．2 有机污染和胁迫以及耐受作用

1．2．3 石油污染和胁迫以及耐受作用

1．2．4 盐碱地盐胁迫以及耐受作用

1．3 植物根际微生物概述

1．4 植物根际微生物作用机制

1．4．1 植物根际微生物的直接作用机制

1．4．2 植物根际微生物的间接作用机制

1．5 科研背景与意义

第二章 污染土壤的根际土壤采集和根际微生物分离

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 仪器设备

2．2．2 污染土壤类型分布

2．2．3 试剂及材料

2．2．4 培养基及溶液

2．3 实验方法

2．3．1 污染土壤的根际土壤采集

2．3．2 油菜循环富集实验

2．3．3 末端稀释计数

2．3．4 可培养根际微生物分离保藏

2．4 结果与分析

2．4．1 土壤样品采集结果

2．4．2 油菜循环富集结果

2．4．3 可培养根际微生物分离结果

2．5 讨论

2．6 小结

第三章 产ACC脱氨酶 (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase) 根际微生物的筛选和鉴定

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 仪器设备

3．2．2 试剂及材料

3．2．3 培养基

3．2．4 细菌

3．2．5 引物序列

3．3 实验方法

3．3．1 细菌培养方法

3．3．2 筛选具有ACC脱氨酶的根际微生物

3．3．3 合成ACC脱氨酶关键基因的分子鉴定

3．3．4 根际微生物ACC脱氨酶活性测量

3．3．5 3-吲哚乙酸(IAA)含量检测

3．4 实验结果与分析

3．4．1 含ACC脱氨酶的PGPR菌筛选结果

3．4．2 acdS基因序列分析

3．4．3 ACC脱氨酶活性

3．4．4 3-吲哚乙酸(IAA)含量

3．5 讨论

3．6 小结

第四章 根际微生物的抗菌物质分子鉴定和种属鉴定

4．1 前言

4．2 实验材料

4．2．1 仪器设备

4．2．2 试剂及材料

4．2．3 培养基及溶液

4．2．4 细菌和真菌

4．2．5 引物序列

4．3 实验方法

4．3．1 细菌和真菌培养方法

4．3．2 体外抑制油莱核盘菌的平板对峙实验

4．3．3 根际微生物的代谢特性

4．3．4 根际微生物抗生素检测

4．3．5 根际微生物种属鉴定

4．4 实验结果与分析

4．4．1 体外抑制实验结果

4．4．2 根际微生物代谢产物结果

4．4．3 根际微生物抗生素分子鉴定结果

4．4．4 根际微生物种属鉴定结果

4．4．5 根际微生物抗生素基因序列测序及比对

4．5 讨论

4．6 小结

第五章 根际微生物促进生长、耐受逆境和温室生物防治实验

5．1 前言

5．2 实验材料

5．2．1 仪器设备

5．2．2 试剂及材料

5．2．3 培养基

5．2．4 细菌和油菜品种

5．3 实验方法

5．3．1 细菌和油菜培养方法

5．3．2 油菜根延长实验

5．3．3 根际微生物耐受逆境实验

5．3．4 根际微生物解磷实验

5．3．5 根际微生物温室抑制油菜核盘菌实验

5．4 实验结果与分析

5．4．1 油菜根延长实验结果

5．4．2 根际微生物耐受逆境结果以及降解有机磷能力

5．4．3 根际微生物温室抑制油菜核盘菌结果

5．5 讨论

5．6 小结

第六章 总结与展望

6．1 总结

6．2 展望

参考文献

附图

致谢