基于秀丽线虫评估三种环境激素类农药的环境毒性研究

摘要

人类在改造环境的同时，也使环境受到不同程度的污染，环境污染又反过来干扰和破坏了人类正常生活以及生物的生长繁衍，甚至使生物赖以生存的生态环境失衡，因此加强环境监测和防治迫在眉睫。环境激素污染是继燃料和尾气等大气污染之后，新提出的一种环境污染，由于其具有较高的隐蔽性，很容易被人们忽视，然而长期接触环境激素会使生物包括人类产生不良反应。环境激素的种类有很多，其中约有70％的环境激素为农药，且大部分农药为环境激素。传统的仪器分析大都无法评价各成分的毒性效应，而指示生物毒理检测法可以弥补这方面的不足。近年来，模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）由于其自身特点和研究的深入，被广大国内外学者应用于环境监测和毒性评估。目前利用秀丽隐杆线虫对激素类农药污染进行毒性评估已有一些报道，但是此类研究大部分侧重个体水平机理研究，将秀丽隐杆线虫种群水平各指标应用到毒理学研究中鲜有报道，本论文利用线虫Caenorhabditis elegans作为指示生物，以敌敌畏、久效磷和乐果作为染毒污染物，检测了环境激素类农药对线虫的急性毒性，并在亚致死浓度下，从个体水平和种群水平上研究了线虫各指标的变化，并对其机制进行了探讨，判断了可以用于环境激素类农药环境污染监测和评估的生物学指标。
　　检测了农药对秀丽隐杆线虫的急性毒性，单一毒性实验结果:4 h LC50:敌敌畏为47.09±1.41μmol/L，久效磷为18.88±0.21 mmol/L，乐果为69.95±0.12mmol/L;联合毒性实验结果:敌敌畏与久效磷为协同作用，且高剂量混合协同作用更加明显;敌敌畏与乐果也为协同作用，且比与久效磷的效果更加明显;乐果和久效磷为相加作用。
　　从乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）活性、摄食率和运动能力三个方面检测了敌敌畏、久效磷和乐果对C.elegans的神经毒性作用，结果显示:AChE活性随着农药染毒浓度的增加而逐渐降低，为剂量效应关系。三种农药也在不同程度上抑制了线虫的摄食率，且摄食抑制率与AChE活性抑制率之间具有明显的线性相关关系，R2值分别为0.8917、0.7590、0.8907。同时这三种农药也在不同程度上抑制了线虫的基本运动能力，向前运动行为与农药浓度呈现明显的剂量效应关系，且向前运动抑制率与AChE活性抑制率之间也具有一定的线性相关关系，R2值分别为0.6284、0.5980、0.7213。
　　以体长、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性、谷胱甘肽(glutathione，GSH)总含量和活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量作为生物学终点，检测了这三种农药对秀丽隐杆线虫生理生化指标的影响，结果显示:染毒后线虫的生长速度受到抑制，但是随着恢复时间的延长，线虫的生长在一定时间内反而会有所提高，来减少之前环境不适引起的生长迟缓，但是如果外源污染物浓度过高却很难恢复到正常水平。线虫体内谷胱甘肽总含量和SOD酶活性均与三种农药呈负相关的剂量效应关系。敌敌畏对线虫体内CAT酶活性影响不大，但是线虫体内CAT酶活性与久效磷和乐果均为负相关的剂量效应关系。线虫体内ROS含量与三种农药呈正相关的剂量效应关系。
　　利用改良的半流体培养基和生命表方法，检测了三种农药对秀丽隐杆线虫实验种群动态的影响，结果显示:三种激素类农药抑制了线虫种群的增长。处理组的总繁殖率TFR、净生殖率R0、生命期望e0和内禀增长率rm，都随着激素类农药浓度的增加，数值减小，且差异具有统计学意义。另外低剂量乐果暴露对线虫内禀增长率rm具有毒物兴奋效应。
　　以乐果作为染毒污染物，从配子发生入手，探讨了环境激素类农药引起秀丽隐杆线虫生殖能力下降的原因，结果显示:乐果24 h暴露可以使线虫生殖腺远端有丝分裂细胞减少，同时减数分裂区的凋亡细胞增多，致使线虫的卵子发生受到抑制。乐果4h暴露，使精子有关基因(fer-1、folt-1和spe-10) mRNA的表达水平明显下降，致使线虫的精子发生受到抑制。
　　综合本论文所有检测结果，可以用于敌敌畏、久效磷和乐果这三种环境激素类农药的毒性评价的生物学终点为:个体水平指标:致死率、半致死浓度、摄食率、基本运动能力、体长、AChE活性、GSH含量、SOD酶活性、CAT酶活性、ROS含量、有丝分裂细胞数、凋亡细胞数和精子有关基因（fer-1、folt-1和spe-10）;种群水平指标:TFR、R0、e0和rm。为将来利用秀丽隐杆线虫监测和评估环境激素类农药的毒性及污染的综合治理提供了一定的实验依据。

目录

声明

摘要

插图或附表清单

引言

1 绪论

1．1 环境激素污染

1．1．1 环境激素

1．1．2 农药污染

1．1．3 环境激素污染的防治

1．2 模式生物秀丽隐杆线虫在环境毒性评估中的应用

1．2．1 秀丽隐杆线虫在环境毒理学领域的应用

1．2．2 基于C．elegans评估激素类农药环境毒性的研究现状

1．2．3 存在的问题

1．3 研究内容和意义

1．4 技术路线

2 三种农药对秀丽隐杆线虫的急性毒性

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 线虫的同步化培养

2．1．3 急性毒性试验

2．1．4 复合胁迫方式判定

2．1．5 数据统计分析

2．2 结果与分析

2．2．1 半致死浓度(LC50)

2．2．2 敌敌畏与久效磷对秀丽隐杆线虫的联合毒性

2．2．3 敌敌畏与乐果对秀丽隐杆线虫的联合毒性

2．2．4 乐果与久效磷对秀丽隐杆线虫的联合毒性

2．3 讨论

2．4 小结

3 三种农药对秀丽隐杆线虫神经毒性的影响

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 线虫的同步化培养

3．1．3 染毒方法

3．1．4 乙酰胆碱酯酶活性检测

3．1．5 摄食率的检测

3．1．6 基本运动能力测定

3．1．7 数据统计分析

3．1 结果与分析

3．2．1 对秀丽隐杆线虫乙酰胆碱酯酶活性的影响

3．2．2 对秀丽隐杆线虫摄食率的影响

3．2．3 对秀丽隐杆线虫基本运动能力的影响

3．2．4 乙酰胆碱酯酶抑制率与摄食抑制率之间的相关性分析

3．2．5 乙酰胆碱酯酶抑制率与向前运动抑制率的相关性

3．3 讨论

3．4 小结

4 三种农药对秀丽隐杆线虫生理生化指标的影响

4．1 材料和方法

4．1．1 材料

4．1．2 线虫的同步化培养

4．1．3 染毒方法

4．1．4 体长的测定

4．1．5 酶活力测定

4．1．6 活性氧(ROS)含量检测

4．2 结果与分析

4．2．1 对秀丽隐杆线虫生长速度的影响

4．2．2 对秀丽隐杆线虫谷胱甘肽(GSH)总含量的影响

4．2．3 对秀丽隐杆线虫体内过氧化氢酶(CAT)的影响

4．2．4 对秀丽隐杆线虫体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响

4．2．5 对秀丽隐杆线虫体内活性氧(ROS)含量的影响

4．3 讨论

4．4 小结

5 三种农药对秀丽隐杆线虫实验种群动态的影响

5．1 材料和方法

5．1．1 材料

5．1．2 线虫的同步化培养

5．1．3 染毒方法

5．1．4 生命表实验

5．1．5 数据处理分析

5．2 结果与分析

5．2．1 生命表

5．2．2 农药对秀丽隐杆线虫生活史特征的影响

5．2．3 对秀丽隐杆线虫生殖能力的影响

5．2．4 对秀丽隐杆线虫寿命的影响

5．2．5 卵在体内孵化现象(BOW)

5．3 讨论

5．4 小结

6 激素类农药对秀丽隐杆线虫生殖毒性机制探讨

6．1 材料和方法

6．1．1 材料

6．1．2 线虫的同步化培养

6．1．3 染毒方法

6．1．4 线虫生殖腺有丝分裂细胞数目的测定

6．1．5 线虫生殖腺细胞凋亡数目的测定

6．1．6 线虫精子发生相关基因的实时定量荧光PCR检测

6．2 结果与分析

6．2．1 乐果对生殖腺细胞有丝分裂的影响

6．2．2 乐果对生殖腺减数分裂区细胞凋亡的影响

6．2．3 乐果对线虫精子发生相关基因表达水平的影响

6．3 讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介及读博期间主要科研成果