星星草(Puccinellia tenuiflora)叶片与叶绿体Na2CO3应答磷酸化蛋白质组学研究

摘要

盐碱胁迫是最主要的非生物胁迫之一，严重影响植物的产量和地理分布。碱性盐造成渗透胁迫和离子伤害，同时带来高pH影响。星星草（Puccinellia tenuiflora）是禾本科盐生植物，能在高达pH10的环境下生存，是研究植物盐碱应答机制的良好模式植物。此前的报道多集中于星星草中性盐应答生理生态学分析，缺乏碱性盐应答机制的研究。　　本研究利用定量蛋白质组学与分子生理学研究策略分析了星星草叶绿体Na2CO3应答机制。研究了Na2CO3应答中星星草快速叶绿素荧光动力学、活性氧清除途径、叶片蛋白质丰度变化模式、叶片和叶绿体磷酸化修饰蛋白质动态变化，以及叶绿体磷酸化蛋白质同源基因的表达模式。发现，104种叶片蛋白质的丰度在Na2CO3胁迫下发生显著变化，亚细胞定位预测结果表明这些蛋白质大部分定位在叶绿体。同时，利用基于同位素标记相对与绝对定量技术和稳定同位素二甲基标记技术分析了Na2CO3应答过程中叶片和叶绿体中84种蛋白质的磷酸化水平变化。这些蛋白质的丰度与磷酸化水平变化揭示了星星草Na2CO3应答的分子生理策略。星星草通过调整热耗散、状态转换、环式电子传递、光呼吸、光系统Ⅱ损伤修复、光系统Ⅰ活性，活性氧平衡等生理过程应答Na2CO3处理条件。此外，利用实时荧光定量PCR方法对28种叶绿体磷酸化蛋白质同源基因表达进行分析发现，在Na2CO3应答过程中有10种基因表达下调，3种基因维持稳定表达，15种基因显著上调表达;这些上调表达基因对胁迫下细胞内的光合作用、Na+运输、Ca2+信号等过程十分重要。　　本文的研究初步表明，星星草叶片与叶绿体在基因表达、蛋白质丰度，以及蛋白质翻译后修饰等多个水平上协同作用应答Na2CO3胁迫。星星草Na2CO3应答策略主要包括:(1)调节光系统Ⅱ捕光蛋白复合体的迁移、重组以及可逆磷酸化，维持光系统Ⅱ和光系统Ⅰ之间的能量平衡，阻止过剩光能对光系统Ⅱ的损伤;(2)增强光系统Ⅰ环式电子传递，保证有效光合作用;(3)增强光呼吸途径，避免电子传递链过度还原;(4)降低叶绿素含量，减少过剩光能吸收，避免叶绿素合成中间产物的积累;(5)利用各种活性氧清除途径减轻氧化胁迫伤害;(6)促进Na+的区室化，加强甘氨酸甜菜碱的积累，维持细胞内离子与渗透平衡;(7)调节叶绿体类囊体膜结构，避免对光合机构造成伤害;(8)协同调节细胞核基因与叶绿体基因编码的蛋白质合成、组装与降解过程。　　本文的研究结果为深入认识星星草叶绿体Na2CO3应答的分子生理机制提供了重要信息。

目录

摘要

1 绪论

1．1 盐碱胁迫对植物生长的影响

1．2 植物盐碱应答的生理机制

1．2．1 渗透调节物质积累

1．2．2 Na+外排和区室化

1．2．3 细胞内活性氧自由基的清除

1．3 植物盐碱应答的分子机制

1．3．1 叶绿体抗氧化防御系统

1．3．2 叶绿体类囊体膜重塑以及光系统Ⅱ活性调节

1．3．3 光合作用与光呼吸途径

1．3．4 叶绿体内的渗透与离子平衡

1．3．5 ABA和蛋白激酶信号

1．3．6 叶绿体基因表达和蛋白质周转

1．4 植物盐碱应答磷酸化蛋白质组学研究进展

1．4．1 稳定同位素标记的定量磷酸化蛋白质组学技术

1．4．2 二氧化钛磷酸化肽段富集技术

1．4．3 植物盐碱应答磷酸化蛋白质组学研究概述

1．5 星星草盐碱应答机制研究进展

1．5．1 星星草盐碱应答分子生理学研究进展

1．5．2 星星草盐碱应答转录组学与蛋白质组学研究进展

1．6 研究目的和意义

2 实验材料与方法

2．3 星星草叶片与叶绿体Na2CO3应答生理学分析

2．3．1 快速叶绿素荧光动力学OJIP曲线测定

2．3．2 渗透调节物质甘氨酸甜菜碱含量测定

2．3．4 叶片抗氧化剂含量测定

2．3．5 叶片抗氧化酶活性测定

2．3．6 叶绿体抗氧化剂含量测定

2．3．7 叶绿体抗氧化酶活性测定

2．4．1 叶片丰度变化蛋白质的胶内酶切与质谱鉴定

2．4．2 叶片丰度变化蛋白质的数据库搜索与蛋白质功能注释

2．5．3 叶片磷酸化肽段TiO2富集

2．5．4 叶片磷酸化蛋白质质谱鉴定、数据库搜索与定量分析

2．6 星星草叶绿体Na2CO3应答磷酸化蛋白质组学分析

2．6．1 叶绿体蛋白质样品制备、还原、烷基化与酶解

2．6．2 叶绿体蛋白质稳定同位素二甲基标记

2．7 星星草Na2CO3应答蛋白质与磷酸化蛋白质的生物信息学分析

2．7．1 叶片与叶绿体蛋白质和磷酸化蛋白质功能分类、亚细胞定位预测以及聚类分析

2．7．2 叶片与叶绿体磷酸化蛋白质三维结构预测

2．8．2 同源基因cDNA序列查找、引物设计与合成

2．8．3 同源基因的qRT-PCR分析与结果计算

3 结果

3．1．2 星星草叶片Na2CO3应答甘氨酸甜菜碱含量分析

3．1．3 星星草叶片Na2CO3应答O2-生成速率与H2O2含量分析

3．1．5 星星草叶片Na2CO3应答抗氧化酶活性分析

3．1．6 星星草叶绿体Na2CO3应答抗氧化剂含量分析

3．1．7 星星草叶绿体Na2CO3应答抗氧化酶活性分析

3．2 星星草叶片Na2CO3应答定量蛋白质组学分析

3．2．1 星星草叶片Na2CO3应答蛋白质分析

3．2．2 星星草叶片Na2CO3应答蛋白质的功能类群特征

3．3 星星草叶片Na2CO3应答磷酸化蛋白质组学分析

3．3．1 星星草叶片磷酸化蛋白质的鉴定与定量分析

3．3．2 星星草叶片磷酸化蛋白质的功能类群特征

3．4 星星草叶绿体Na2CO3应答磷酸化蛋白质组学分析

3．4．1 星星草叶绿体磷酸化蛋白质的鉴定与定量分析

3．4．2 星星草叶绿体磷酸化蛋白质功能类群特征

3．5 星星草Na2CO3应答磷酸化蛋白质三维结构分析

3．6 星星草叶绿体Na2CO3应答磷酸化蛋白质同源基因表达分析

3．7 星星草叶绿体Na2CO3应答蛋白质的免疫印迹分析

4 讨论

4．1．1 星星草Na2CO3应答光系统Ⅱ与光系统Ⅰ之间的光能平衡

4．1．2 星星草Na2CO3应答的热耗散机制

4．1．3 星星草Na2CO3应答光系统Ⅰ环式电子传递变化

4．2 星星草Na2CO3应答光系统Ⅱ的损伤修复过程

4．3 星星草Na2CO3应答磷酸化蛋白质对光系统Ⅰ与ATP合酶活性调节

4．4 星星草Na2CO3应答二氧化碳同化与光呼吸作用的变化

4．5 星星草Na2CO3应答叶绿素生物合成的调节

4．7 星星草Na2CO3应答叶片与叶绿体ROS平衡

4．8 星星草Na2CO3应答渗透平衡、离子稳态和信号转导

4．9 星星草Na2CO3应答碳氮代谢、基因表达和蛋白质周转

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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