木犀草素联用紫杉醇对食管癌的体内外抗肿瘤作用及机制研究

摘要

目的：1.探讨木犀草素与紫杉醇在体外联用对食管癌细胞增殖、迁移、凋亡的影响及作用机制。　　2.探讨木犀草素与紫杉醇在体内联用对食管癌裸鼠移植瘤生长、凋亡的影响及分子机制，并对此给药方案的潜在毒性进行初步评价。　　方法：1.采用SRB实验检测木犀草素与紫杉醇联用对于食管癌细胞活力的影响。使用细胞增殖与示踪检测试剂盒检测木犀草素与紫杉醇联用对食管癌细胞增殖能力的影响。采用克隆形成实验检测木犀草素与紫杉醇联用对食管癌细胞克隆形成的影响。　　2.采用划痕实验、Transwell实验检测木犀草素与紫杉醇联用对于食管癌细胞迁移的影响;使用倒置显微镜观察木犀草素与紫杉醇联用对食管癌细胞形态的影响;采用Western Blotting实验检测木犀草素与紫杉醇联用对SIRT1及EMT相关蛋白的表达的影响。　　3.使用细胞凋亡检测试剂盒检测木犀草素与紫杉醇联用对于食管癌细胞凋亡的影响，使用活性氧检测试剂盒检测木犀草素与紫杉醇联用对于食管癌细胞内活性氧水平的影响，采用Western Blotting实验检测木犀草素与紫杉醇联用对线粒体凋亡通路、ROS/JNK通路相关蛋白表达的影响。　　4.建立食管癌细胞裸鼠移植瘤模型，检测木犀草素与紫杉醇联用对于食管癌裸鼠移植瘤生长的影响。通过HE染色及TUNEL染色实验检测木犀草素与紫杉醇联用对于食管癌细胞体内凋亡的影响。通过HE染色实验及裸鼠体重监测对两种药物联用的潜在毒性进行初步评价。通过Western Blotting实验检测裸鼠移植瘤组织中SIRT1、EMT相关蛋白、线粒体凋亡通路相关蛋白、ROS/JNK通路相关蛋白表达情况，探讨木犀草素与紫杉醇联用的体内机制。　　结果：1.木犀草素与紫杉醇联用协同抑制食管癌细胞活力;木犀草素与紫杉醇联用协同抑制食管癌细胞增殖及克隆形成。　　2.木犀草素和紫杉醇联用协同抑制食管癌细胞迁移并改变食管癌细胞形态;木犀草素和紫杉醇联用协同抑制SIRT1蛋白的表达，抑制间质标志蛋白N-Cadherin、β-Catenin、Vimentin的表达，促进上皮标志蛋白E-Cadherin、Claudin-1、ZO-1的表达。　　3.木犀草素与紫杉醇联用可协同促进食管癌细胞凋亡，协同抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达，促进促凋亡蛋白Bax的表达，促进BH3-only死亡因子Noxa的表达，促进Cleaved Caspase-9蛋白和Cleaved Caspase-3蛋白的表达。木犀草素与紫杉醇联用可协同提高食管癌细胞内的ROS水平，协同上调p-ASK1、p-MKK4、JNK及p-JNK蛋白的表达。　　4.在食管癌细胞裸鼠移植瘤模型上，木犀草素与紫杉醇联用可以协同抑制裸鼠移植瘤的生长并诱导食管癌裸鼠移植瘤细胞的体内凋亡;木犀草素与紫杉醇联用对食管癌裸鼠移植瘤中SIRT1、EMT相关蛋白、线粒体凋亡通路相关蛋白、ROS/JNK通路相关蛋白的影响与体外结果基本一致。木犀草素与紫杉醇联用对裸鼠体重没有明显影响，对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏没有明显的毒性。　　结论：1.木犀草素与紫杉醇在体外联用时可协同调控食管癌细胞的增殖、迁移及凋亡;其抑制细胞迁移的分子机制与抑制SIRT1及细胞EMT进程相关，其诱导凋亡的机制与ROS/JNK通路和线粒体凋亡通路的激活相关。　　2.木犀草素与紫杉醇在体内联用时可协同抑制食管癌裸鼠移植瘤的生长、促进肿瘤细胞的体内凋亡。在治疗剂量下，两种药物联用无明显毒性。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

第一章前言

参考文献

第二章木犀草素与紫杉醇联用体外抗食管癌效果及机制研究

2．1实验材料

2．1．1实验细胞株

2．1．2主要试剂

2．1．3实验用主要仪器

2．1．4常用溶液配制

2．2实验方法

2．2．1细胞培养

2．2．2细胞活力测定实验

2．2．3克隆形成实验

2．2．4细胞增殖与示踪实验

2．2．5划痕实验

2．2．6 Transwell实验

2．2．7细胞凋亡实验

2．2．8 ROS测定实验

2．2．9提取细胞蛋白

2．2．10 Western blotting实验

2．2．11数据统计

2．3实验结果

2．3．1木犀草素单用抑制食管癌细胞活力

2．3．2木犀草素单用抑制食管癌细胞迁移

2．3．3木犀草素与紫杉醇联用抑制食管癌细胞活力

2．3．4木犀草素与紫杉醇联用抑制食管癌细胞克隆形成

2．3．5木犀草素与紫杉醇联用抑制食管癌细胞增殖

2．3．6木犀草素与紫杉醇联用影响食管癌细胞形态

2．3．7木犀草素与紫杉醇联用抑制食管癌细胞迁移

2．3．8木犀草素与紫杉醇联用影响SIRT 1及EMT相关蛋白表达

2．3．9木犀草素与紫杉醇联用诱导食管癌细胞凋亡

2．3．10木犀草素与紫杉醇联用影响线粒体凋亡通路相关蛋白表达

2．3．11木犀草素与紫杉醇联用提高食管癌细胞内ROS水平

2．3．12木犀草素与紫杉醇联用影响ROS／JNK通路蛋白表达

2．4讨论

2．5小结

参考文献

第三章木犀草素与紫杉醇联用体内抗食管癌效果及机制研究

3．1实验材料

3．1．1实验动物

3．1．2实验用主要试剂

3．1．3实验用主要仪器

3．1．4常用溶液配制

3．2实验方法

3．2．1细胞培养

3．2．2裸鼠移植瘤实验

3．2．3 HE染色实验

3．2．4 TUNEL染色实验

3．2．5组织蛋白提取

3．2．6 Western Blotting实验

3．2．7统计学分析

3．3实验结果

3．3．1木犀草素与紫杉醇联用协同抑制食管癌裸鼠移植瘤生长

3．3．2木犀草素与紫杉醇联用协同诱导体内细胞凋亡

3．3．3木犀草素与紫杉醇联用协同抗食管癌的体内机制

3．3．4木犀草素与紫杉醇联用的体内毒性初步评价

3．4讨论

3．5小结

参考文献

结论

综述木犀草素抗肿瘤活性研究进展

个人简历

致谢