河南不同地区阴道毛滴虫临床分离株的遗传多态性研究

摘要

目的：　　阴道毛滴虫病是由鞭毛型寄生原虫：阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）感染而引起的一种最为流行的性传播疾病。男女两性均可感染，女性阴道毛滴虫感染首先对外阴、阴道及子宫颈造成损害，其次会累及尿道造成严重后果；阴道毛滴虫感染孕期女性会使得早产率增加、胎膜早破、新生儿体重不足的等，并且阴道毛滴虫可经产道由母亲传给胎儿。男性阴道毛滴虫病可导致慢性前列腺炎、非淋菌性尿道炎等。该病同样可以增加人类免疫缺陷病毒（HIV）感染及宫颈癌的风险。对阴道毛滴虫种群遗传特征的了解有助于我们对阴道毛滴虫病的预防和控制。目前我国有关阴道毛滴虫种群遗传结构方面的研究还比较少。本研究首先使用随机扩增多态性DNA技术对阴道毛滴虫不同分离株的遗传差异进行研究，并对遗传差异与临床症状之间的相关性进行了分析；其次基于18S rRNA序列对取自河南省7个不同地理区域的阴道毛滴虫临床分离株的遗传变化进行了分析；最后从阴道毛滴虫基因组序列中筛选出了21种微卫星序列和6个单拷贝基因作为合适的遗传标记，并采用荧光原位杂交方法将这些微卫星基因及6个单拷贝基因在阴道毛滴虫染色体组中的位置进行了定位。　　材料与方法：　　1.随机扩增多态性DNA标记（RAPD）分析：使用10条随机引物对40株阴道毛滴虫临床分离株进行基因分型及种间多态性鉴定。根据电泳条带的有、无对每一个分离株进行赋值（有条带赋值为1，无条带则赋值为0）。使用MEGAv5.0中的非权重聚类配对分析法（UPGMA）进行系统发育关系的推断。使用10条RAPD随机引物所得到的数据绘制聚类分析图。　　2.基于18S rRNA序列的遗传变化分析：对河南省7个不同地理区域（郑州市、安阳市林州市、三门峡市灵宝县、开封市兰考县、平顶山市叶县、驻马店市正阳县及南阳市淅川县）的女性感染患者进行阴道毛滴虫标本的收集。18S rRNA序列的比对在Clustal Xv2.0软件中进行。分别使用最大简约和贝叶斯推断两种方法对不同单倍型之间的系统发育关系进行推断。并使用Network v.4.5绘制网络结构图。基于种群分化的固定系数（FST）值对不同地理种群之间的遗传差异水平进行评估。使用岐点分布分析对阴道毛滴虫的种群波动历史进行评估。　　3.微卫星多态性分析：使用基因组数据库资源对阴道毛滴虫基因组序列信息进行挖掘。基于SciRoKo工具，分别使用2、3、4、5、6核苷酸重复对基因组进行搜索以查找微卫星序列。使用BLASTP对单拷贝基因进行鉴定。采用荧光原位杂交方法将微卫星序列标注到染色体相应位置。分别使用邻接法和最大似然方法进行系统发育关系推断，使用1000次自展抽样对每一分支的支持值进行评估。每个基因首先进行单独分析，然后根据拓扑结构进行多基因联合分析，并绘制网络结构图。　　结果：　　1. RAPD基因分型：使用10条随机引物从40株阴道毛滴虫分离株中共获得124条RAPD条带，其中117条为多样性条带，7条为所有分离株共有条带。40株阴道毛滴虫分离株被聚为四个类群组，并且每组所含的分离株与其临床表现（无症状型、轻度症状型、中度症状型和重度症状型）相一致。每个类群组均具有一些特异的分子标记，一条长度为490 bp的RAPD条带只出现在有临床症状的阴道毛滴虫分离株中，在无症状分离株中没有出现。　　2.18S rRNA序列的遗传多态性：对7个地理区域的32株阴道毛滴虫分离株的18S rRNA进行扩增并双向测序。这些18S rRNA序列共鉴定出了18种单倍型，每个地理种群及整个毛滴虫种群均具有较高的单倍型多态性（Hd）而其核苷酸多样性（Pi）水平却较低，有72.51％的分子遗传变化出现在种群内部。系统发育分析表明其亲缘关系与地理分布之间并没有明显的相关性。中性检验与岐点分布均支持毛滴虫种群处于扩张期。　　3.微卫星遗传标记：基于毛滴虫基因组数据筛选出了21个适用于毛滴虫种群遗传结构的微卫星标记及6个单拷贝基因。并将这些微卫星标记标注到染色体的相应位置证明其可以稳定表达。使用Network分析和系统发育分析证实这些微卫星标记在推断阴道毛滴虫不同分离株之间的进化关系中具有较多的信息位点，且鉴定了单拷贝基因的多态性水平。　　结论：　　1.长度为490 bp的RAPD条带可以作为毛滴虫感染致病机制的潜在遗传标记，毛滴虫的基因型与其感染的临床症状之间具有相关性；　　2.阴道毛滴虫河南分离株的遗传多态性水平较低，毛滴虫河南分离株属于一个种群，且此虫种群正处于历史扩张期；　　3.本实验筛选的微卫星分子标记可用于对实验室毛滴虫株的鉴定、监测及作为探究阴道毛滴虫遗传多态性和种群结构的工具。

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英文缩略词表

1 前言

1.1 阴道毛滴虫及阴道毛滴虫病

1.2 阴道毛滴虫的遗传特征研究

1.3 目的与意义

2 材料与方法

2.1 试剂及仪器

2.2 培养基及主要试剂的配置

2.3 阴道毛滴虫的培养

2.4 RAPD分析

2.5 基于18S序列的分析

2.6 微卫星标记分析

3 结果

3.1 RAPD基因分型

3.2 毛滴虫18S rRNA序列多态性分析

3.3 微卫星标记基因型分析

4 讨论

4.1 基于随机扩增多态性DNA的分型

4.2毛滴虫18S rRNA序列多态性

4.3 毛滴虫微卫星序列多态性

5 结论

参考文献

综述:阴道毛滴虫的流行及遗传多态性研究现状

1 流行

2 遗传多态性

3 结语

参考文献

个人简历

在学校期间发表的学术论文

致谢