太行菊(Opisthopappustaihangensis)产黄酮内生真菌的筛选和鉴定

摘要

药用植物内生真菌可代谢生成和宿主植物相似的药用成分，其中抗菌、抗肿瘤内生真菌次级代谢物引起广泛研究。太行菊目前仅局限于分类学和组织培养等研究，太行菊内生真菌目前还未见报道。太行菊中起抗氧化、抗肿瘤和治疗心血管疾病的是黄酮类化合物。本研究目的在于筛选产黄酮的太行菊内生真菌，并对产黄酮内生真菌进行分类鉴定。本论文主要结果如下：　　（1）本文对太行叶片采取组织分离法进行了内生真菌的分离和筛选，利用菌丝顶端纯化法和Z字形划线法两种方法对内生真菌进行了纯化，用试管斜面保存法和无菌水保存法对内生真菌进行了保存。实验结果表明：最佳的表面消毒方法是75％的酒精消毒45s后再用升汞消毒45s。并且共筛选出太行菊内生真菌37株。　　（2）本文通过使用5种黄酮类化合物显色剂 AlCl3、硝酸铝-亚硝酸钠、NaOH、盐酸-镁粉和FeCl3分别对太行菊叶片中分离到的内生真菌的发酵液和菌丝体进行黄酮类物质的显色反应。其中，硝酸铝-亚硝酸钠是黄酮类化合物的特异性显色剂，为确定产黄酮菌株的必要条件。选择包含硝酸铝-亚硝酸钠反应和其它两种显色反应阳性的菌株为产黄酮内生真菌。显色反应分为两个方面，包括发酵液的显色反应和菌丝体的显色反应。将筛选出的发酵液中有黄酮类物质的内生真菌进行菌丝体的显色反应。认为发酵液和菌丝体都含有黄酮类化合物的内生真菌为太行菊叶片的产黄酮菌株。结果表明，产黄酮菌株为：T1，T2，T8，T9，S9，S10，R1，R2。　　（3）用高效液相色谱法对产黄酮菌株的黄酮类物质进行定性和定量分析。本文使用4中黄酮类标品：槲皮素、山奈酚、芦丁和异鼠李素。以纯甲醇溶解，进行稀释后用高效液相仪检测峰面积和出峰时间，以质量浓度(mg/ml)为横坐标，以吸光度值为纵坐标，分别绘制标准曲线。结果表明，只产芦丁的菌株有T1、T8、R1，只产槲皮素的是 T2，同时产芦丁和槲皮素的是 R2，而 T9、S9、S10同时产芦丁、异鼠李素和槲皮素。同时产三种黄酮类物质的菌株槲皮素、芦丁、异鼠李素最高产量分别为0.0116±0.0034mg/ml，0.0374±0.0055mg/ml，0.0460±0.0047mg/ml。这些产黄酮类物质的菌株普遍产芦丁，且芦丁含量相对较高，实验中产黄酮菌株均不含山奈酚。　　（4）对8株产黄酮类化合物内生真菌进行形态学鉴定，对菌落形态、颜色，孢子梗形态、孢子形态进行观察和描述，参考有关文献和《半知菌属图解》（H.L.巴尼特、B.B.亨特著）以确定8株内生真菌的种属分类地位。　　（5）本文使用分子生物学手段对8株内生真菌进行了鉴定。利用真菌基因组 DNA提取试剂盒分别对8株内生真菌提取了基因组 DNA，本文选取真菌通用引物ITS1和ITS4扩增克隆真菌rDNA的ITS区段。在琼脂糖凝胶电泳检测合格后，将 PCR产物送上海生物工程有限公司进行测序。结果表明，8株产黄酮内生真菌扩增出的ITS区段为500-600bp。　　将测序得到的序列在Genebank中进行BLAST比对，获得其同源序列，经过BLAST比对得到与该核酸序列同源性由高到低的一系列序列信息。记录并下载通过与原始序列比对 score值较高的同源系列，建立系统发育树进行分析。从而用分子生物学方法确定产黄酮内生真菌的种属地位。结果表明：产黄酮太行菊内生真菌的种属地位与形态学结果一致，可以确定 T1、T2、T8、T9、S9、S10、R1、R2分别为镰孢菌属(Fusarium)、镰孢菌属(Fusarium)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、青霉属(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)。

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1 文献综述

1.1 植物内生真菌的研究背景和研究进展

1.1.1 内生真菌的概念和分布

1.1.2 内生真菌的次级代谢产物、与宿主植物的关系和生物学意义

1.1.3 国内外在内生真菌方面的研究方向

1.1.4 国内外药用植物内生真菌的研究进展

1.2 太行菊及其药用成分的研究现状

1.3 内生真菌的分离纯化

1.4 内生真菌鉴定的研究

1.5 本研究的内容、目的和意义

2 产黄酮内生真菌的筛选和初步研究

2.1 材料和方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 培养基

2.1.3 试验用到的主要试剂

2.1.4 试验用到的仪器

2.2试验方法

2.2.1 最佳表面消毒剂和消毒时间的确定

2.2.2 内生真菌的分离、纯化

2.2.3表面消毒的检验

2.2.4 内生真菌的保存

2.2.5 内生真菌摇瓶发酵培养

2.2.6 产黄酮内生真菌的筛选

2.2.7 菌体内含物黄酮类物质的提取

2.2.8 黄酮类化合物的显色反应

2.2.9 产黄酮菌株发酵液的高效液相色谱分析

2.2.10 黄酮含量标准曲线的绘制

2.2.11 待测菌株黄酮类物质含量的测定

2.3 结果和分析

2.3.1表面消毒的结果

2.3.2 内生真菌的分离结果

2.3.3 发酵液显色反应结果

2.3.4菌丝体显色反应结果

2.3.5黄酮标品的高效液相色谱结果

2.3.6 超声破碎后的样品（带菌丝体）高效液相色谱结果

2.4 小结和讨论

3 产黄酮内生真菌的分类鉴定

3.1 材料和方法

3.1.1试验用到的仪器和试剂

3.1.2 产黄酮内生真菌的形态学初步鉴定

3.1.3 提取和纯化基因组DNA

3.1.4 DNA纯度的检验

3.1.5 ITS序列的扩增、克隆和测序

3.1.6 分子鉴定和系统发生关系分析

3.2 结果和分析

3.2.1产黄酮内生真菌的形态学描述

3.2.2 ITS序列的扩增

3.2.3 测序结果

3.2.4 NCBI中BLAST比对的结果

3.2.5 系统发育树的构建

3.2.6 产黄酮内生真菌种属地位的确定

3.3 小结和讨论

4 结论与讨论

4.1 结论

4.2 讨论

参考文献

致谢