结直肠癌临床血清标志物早期辅助诊断模型及初级凋亡基因调控网络的探讨

摘要

研究背景：　　结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化道系统常见的恶性肿瘤之一，近年来随着人们饮食结构和饮食习惯的改变、生活水平质量的提高，其发病率和死亡率呈上升趋势，约有1/3结直肠癌患者就诊时已属晚期，相对生存率低于40％，很大程度上延误了治疗。因此，寻找用于早期诊断结直肠癌的特异性标志物对提高患者生存率和生活质量具有重要意义。　　研究目的：　　本研究旨在筛选可用于结直肠癌早期诊断的生物标志物，建立结直肠癌早期血清诊断模型及并初步探讨结直肠癌基因凋亡调控网络模型，为临床上结直肠癌早期诊断、靶向治疗结直肠癌提供一定的理论依据。　　材料与方法：　　1.以CNKI、维普、万方数据库、PubMed和MEDLINE数据库为文献检索的主要来源，中文检索词为“结直肠癌”，“血清肿瘤标志物”，“基因标志物”，“早期诊断”，英文检索词为“colorectal cancer”，“serum tumor markers”，“gene markers”，“early diagnosis”，搜集1990年1月1日至2013年12月31日国内外公开发表的关于结直肠癌早期诊断的血清标志物和基因标志物的相关研究文献，纳入研究，提取有效数据，并对纳入文献进行评估，然后利用Meta-Disc软件进行诊断性试验Meta分析。　　2.收集2013年1月至2013年12月到郑州大学第一附属医院消化科就诊的结直肠癌手术治疗患者100例，其中男56例，女44例，年龄25～82岁，中位年龄为59.0岁。同期收集在本科室住院非结直肠癌患者50例作为良性对照组，其中男21例，女29例，年龄为32～80岁，中位年龄52.5岁。上述全部病例诊断均经过临床、内镜及病理学证实。所有受试者均签署知情同意书。采用酶联免疫法检测实验组和对照组患者血清中经Meta分析筛选出的CEA、CA50、HSP60、CYFRA21-1、TPA、AFP、CA199、CA242、CA724、CA125、CA153、UGT1A8等12种血清标志物水平，然后采用Logistic回归分析和支持向量机（Battacharyya-SVM）两种方法分别建立结直肠癌早期诊断模型。　　3.利用基因本体数据库（GO）和京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG）对第一部分经Meta分析筛选出的WWOX、K-ras、COX-2、p53、APC、DCC和PTEN等七种基因标志物进行GO功能分析和KEGG信号通路分析，初步建立结直肠癌初级凋亡调控网络模型。而WWOX是一种新发现的结直肠癌抑癌因子， WWOX参与的凋亡信号通路尚不清楚，因此利用 RT-PCR、TUNEL法检测WWOX基因对凋亡调控网络中相关节点表达水平及对结直肠癌Colo205细胞系凋亡的影响，验证WWOX基因参与的凋亡信号通路。　　研究结果：　　1、结直肠癌早期诊断生物标志物的Meta分析　　血清标志物诊断性试验 Meta分析结果显示：纳入本次 Meta分析的文献共64篇。CEA、CA242、HSP60、CA724、CA199、CA125、CA50、CYFRA21-1、AFP、CA153、TPA及UGT1A8等12种血清肿瘤标志物的诊断比值比（Diagnostic OR, DOR）分别为7.37(5.90,9.22)、7.15(5.17,9.90)、6.72(1.93,23.45)、6.64(4.47,9.84)、4.80(3.67,6.27)、3.65(1.60,8.36)、3.41(2.09,5.59)、3.19(2.21,4.60)、1.16(0.14,9.82)、1.36(0.73,2.53)、3.21（1.35,7.64）及45.5（11.12,186.24），P值均小于0.01，结果表明12种血清标志物对结直肠癌均有一定的诊断效能。　　基因标志物诊断性试验 Meta分析结果显示：纳入本次 Meta分析的文献共44篇。WWOX、K-ras、COX-2、p53、APC、DCC和PTEN等7种基因标志物的诊断比值比分别为7.56(4.97,11.50)、12.56(6.33,24.90)、10.29(4.00,26.45)、17.42(9.30,32.62)、25.40(7.37,87.50)、54.41(11.28,262.54)和22.39(10.69,46.88)， P值均小于0.01，结果表明七种基因标志物对结直肠癌的诊断效能均较高，其中以DCC基因的诊断效能最高。　　2、结直肠癌血清肿瘤标志物早期诊断模型的建立　　采用Logistic回归分析结果显示，最终纳入回归方程的自变量有3项，分别为CEA、CA199和HSP60，将CEA、CA199、HSP60和Logistic回归模型进行受试者工作特征曲线(ROC)分析，结果表明CEA、CA199、HSP60单独检测及Logistic回归模型对结直肠癌诊断的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.762、0.752、0.825和0.906，P值均小于0.01，该模型的诊断准确率为82.67%，Logistic回归模型的诊断价值优于任一单项指标。分别采用12个血清标志物、巴氏距离超过2的七个血清标志物及巴氏距离超过3的四个血清标志物建立了三个SVM诊断模型，分类准确率分别为73.33%、86.67%和80%，以采用CEA、CA50、CYFRA21-1、CA199、CA724、CA125、UGT1A8等7个指标联合建立SVM诊断模型的分类准确率最高。　　3、结直肠癌基因标志物凋亡调控网络模型的初步建立　　结合GO功能分析和KEGG信号通路分析结果，初步建立了由p53、APC、DCC、K-ras、PTEN、WWOX及COX-2七个基因标志物及其他相关基因组成的结直肠癌初级凋亡调控网络模型。WWOX基因转染 Colo205细胞后， pcDNA4.0/Myc-WWOX转染组、pcDNA4.0/Myc-His空载体转染组以及Colo205细胞对照组三组细胞的凋亡率分别为(12.63±0.43)%、(2.31±0.58)%、(2.20±0.36)%，提示 pcDNA4.0/Myc-WWOX的转染能够使 Colo205细胞系的凋亡率升高，且转染细胞 Colo205中 WWOX基因的 mRNA表达水平均高于pcDNA4.0/Myc-His空载体转染组以及Colo205细胞对照组。Colo205肿瘤细胞中野生型p53 mRNA表达水平较低，而转染质粒pcDNA4.0/Myc-WWOX后，转染细胞Colo205中野生型p53 mRNA表达水平高于pcDNA4.0/Myc-His空载体转染组以及Colo205细胞对照组，提示WWOX基因能够上调p53基因的表达水平。WWOX是通过激活p53信号通路，参与结直肠癌凋亡信号通路。　　结论：　　1.筛选出了对结直肠癌具有一定诊断效能的CEA、CA242、HSP60、CA724、CA199、CA125、CA50、CYFRA21-1、AFP、CA153、UGT1A8及TPA12种血清标志物以及WWOX、K-ras、COX-2、p53、APC、DCC和PTEN7种基因标志物。　　2.建立了 CEA、CA50、CYFRA21-1、CA199、CA724、CA125、UGT1A8等7个血清标志物联合诊断模型，准确率高达86.67%，可辅助结直肠癌患者的早期诊断。　　3.初步探讨了p53、APC、DCC、K-ras、PTEN、WWOX及COX-2七个基因标志物参与的结直肠癌凋亡调控网络模型，可作为结直肠癌靶向治疗的潜在靶点。

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中文摘要

英文摘要

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第一章 结直肠癌早期诊断生物标志物的Meta分析

1 前言

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第二章 结直肠癌血清肿瘤标志物早期诊断模型的建立

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第三章结直肠癌基因标志物凋亡调控网络模型的初步探讨

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

结论

研究创新与不足

1 研究创新

2 研究不足

综述:结直肠癌早期诊断方法的研究进展

附表

攻读博士期间发表的论文及参与的项目