神经干细胞修复面神经损伤的组织工程学研究

摘要

第一部分新生豚鼠海马神经干细胞的培养、鉴定及定量观察 目的： 神经干细胞(NSCs)的研究已逐渐成为国内、外基础及临床医学各专业的重要研究课题。NSCs是一种成体干细胞，存在于胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统的多个区域，属多能干细胞，在一定的微环境中具有自我更新和向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化的能力，且具有极强的可塑性，利用NSCs进行细胞移植治疗或基因治疗有很好的临床应用前景。本实验旨在建立一套完整的方法分离培养豚鼠海马NSCs、定量观察连续传代培养获得的克隆球中NSCs的比例，为进一步分离、纯化NSCs来进行细胞移植治疗提供细胞学帮助和数据依据。 方法：①应用无血清培养技术，加入EGF和bFGF(终浓度为20μg/L)，分离新生豚鼠海马组织进行NSCs的原代、传代培养；用100ml/L胎牛血清对NSCs进行诱导分化培养；将BrdU加入传代培养的细胞培养基中，浓度为10tg/ml。应用免疫细胞化学技术，行Nestin、BrdU、NF、GFAP和S100染色，鉴定NSCs的增殖能力和多分化潜能。②联合应用免疫细胞化学技术和单细胞克隆技术定量观察连续传代培养获得的克隆球中NSCs的比例。 结果：①海马NSCs能够在EGF和bFGF的刺激下分裂增殖，1w左右形成数十到数百个细胞组成的克隆细胞球。光镜下传代培养的细胞形态特点与原代培养无明显差异。②海马NSCs在体外可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和类雪旺细胞样细胞。③原代和次代克隆，均显示Nestin和BrdU阳性标记反应；而分化细胞分别呈NF、GFAP、sl00染色阳性。④随着传代次数的增加，细胞克隆形成率和所形成的克隆球中Nestin阳性细胞的比例均显著减少；在传代第一代及第二代的克隆细胞球中，NSCs的比例最高。 结论：①本研究从新生豚鼠海马组织中分离、培养的细胞为NSCs，所采用的方法是简便、可靠的。②所培养的NSCs增殖能力强，具有稳定的生物活性，可适应长期大量培养的需要。③在传代第一代及第二代形成的克隆细胞球中NSCs的比例最高，可以选择这时候形成的克隆球进行细胞移植治疗。 第二部分豚鼠海马神经干细胞与两种不同载体材料的生物相容性 目的：在应用组织工程修复周围神经的研究中，载体的选择至关重要。理想的载体应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性。本实验选择豚鼠海马NSCs与胶原蛋白海绵、明胶海绵2种载体材料进行体外复合培养，检测其组织相容性，以探讨它们作为周围神经组织工程载体材料的可行性。 方法：体外培养新生豚鼠海马NSCs，传至第2代，将浓度为1×10<'10>/L细胞分别与2种载体材料联合体外培养，于不同时间进行处理，行倒置相差显微镜、光学显微镜及扫描电镜观察，测定2种材料与细胞的吸附率，绘制生长曲线。 结果：NSCs可以在胶原蛋白海绵和明胶海绵上生长，逐渐黏附，分泌细胞外基质，并在其表面及空隙内聚集成细胞球，细胞吸附率分别为37.17％和14.87％，统计学分析有显著差异(P<0.05)；各实验组与对照组之间生长曲线相近，统计学分析无显著差异。 结论：胶原蛋白及明胶2种材料，尤其是胶原蛋白，与NSCs有良好的生物相容性，可以作为周围神经组织工程的支架材料应用于临床。 第三部分豚鼠海马神经干细胞修复兔面神经缺损的实验观察 目的：种子细胞是组织工程研究中的要素之一，形成新生的组织需要有一定数量且不会引起机体免疫排斥反应的种子细胞。因此选择合适的种子细胞，是组织工程研究从实验室向临床应用过渡的关键步骤。本实验通过观察豚鼠海马NSCs修复兔面神经缺损的实验效果，探讨其作为组织工程的种子细胞修复周围神经缺损的可行性。 方法：健康日系大耳白兔28只，随机分为2组，每组14只，均建立一侧面神经颊支缺损10mm模型，用内置胶原蛋白海绵的硅胶管桥接面神经缺损，治疗组在神经导管内植入NSCs，对照组注入生理盐水。NSCs移植前48h用5’-溴尿嘧啶(BrdU)标记。术后12w，进行大体观察、神经电生理检查、HRP逆行示踪、BrdU和S100免疫组织化学染色和组织学观察等检测。 结果：①治疗组神经肌肉动作电位的潜伏期明显短于对照组(P<0．01)，而波幅明显高于对照组(P<0．01)。②治疗组有大量BrdU阳性细胞，且部分阳性细胞同时呈现s1∞双标阳性。对照组未见BrdU阳性细胞。③治疗组再生有髓神经纤维数量、直径和髓鞘厚度与对照组相比明显增加(P<001)。 结论：豚鼠海马NSCs能显著提高兔面神经缺损的修复效果；豚鼠海马NSCs可以作为种子细胞应用于外周神经组织工程。 第四部分构建组织212程化人工神经修复兔面神经缺损 目的：周围神经损伤修复的“金标准”是自体神经移植，但自体神经来源有限、取材后易造成继发畸形和供区感觉减退，因而限制了它在临床的应用。组织工程化人工神经研究的热潮为治疗周围神经损伤带来了新希望。本研究利用组织工程学原理，模仿神经组织的构造，以壳聚糖管作支架替代神经外膜，用胶原蛋白海绵作胞外基质和再生桥，再负载NSCs和神经生长因子(NGF)制备人工神经修复兔面神经10mm的缺损，以寻求可替代自体神经移植的修复材料。 方法：健康日系大耳白兔48只，随机分为3组，每组16只，均建立一侧面神经颊支缺损10mm模型。实验组、对照组和自体移植组分别用自制的2种人工神经和自体面神经桥接神经缺损。术后12w，进行大体观察、神经电生理检查、HRP逆行示踪、BrdU和S100免疫组织化学染色和组织学观察等检测。 结果：①实验组再生神经的神经传导功能明显优于对照组(P<001)；与自体神经移植比较，差异无显著性意义(尸>005)。②实验组有大量BrdU阳性细胞，且部分阳性细胞同时呈现Sl∞双标阳性，表明部分移植的NSCs已经分化成类雪旺氏细胞。对照组和自体移植组未见BrdU阳性细胞。③实验组再生有髓神经纤维数量、直径和髓鞘厚度与对照组相比明显增加(P<001)；与自体移植移植组结果相近(P>005)。 结论：用壳聚糖管、胶原蛋白海绵、NSCs和NGF制备的人工神经符合神经组织学结构，对面神经缺损修复有效，能达到新鲜自体神经移植的效果，为周围神经缺损的修复提供了一种新方法，有可能代替自体神经应用于临床。

目录

文摘

英文文摘

第一部分新生豚鼠海马神经干细胞的培养、鉴定及定量观察

第二部分豚鼠海马神经干细胞与两种不同载体材料生物相容性

第三部分豚鼠海马神经干细胞修复兔面神经缺损的实验观察

第四部分构建组织工程化人工神经修复兔面神经缺损

组织工程化人工神经及其在面神经修复中的应用

英文缩略语

博士研究生在读期间发表的论文

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