脂肪基质细胞诱导分化为星形胶质细胞过程中线粒体凋亡与自噬的关系

摘要

目的：探讨在ADSCs诱导分化为星形胶质细胞过程中线粒体凋亡与自噬的关系，从而为进一步增加获得的ADSCs源性星形胶质细胞数量并延长其存活时间具有重要的科学意义。　　方法：1、参照叶长青等的实验方法，将成人脂肪组织体外分离、培养为 ADSCs，倒置相差显微镜下每日观察 ADSCs的形态学变化。2、将传至第3代的成人 ADSCs，应用以含 IBMX为主要成分的诱导剂诱导其向星形胶质细胞分化，按照诱导时间的不同分为诱导48h、7d、14d、21d组，并在倒置相差显微镜下观察诱导后细胞形态学的变化。3、应用免疫细胞化学法和Western-blotting分别检测未诱导的ADSCs及诱导分化48h、7d、14d、21d的星形胶质细胞特异性标志蛋白胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein, GFAP），Bcl-2蛋白家族蛋白Bcl-2、Bax及细胞色素C（Cytochrome C）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Cysteine aspartate specific protease-3）及微管相关蛋白轻链3（Microtubule-associated protein light chain3, LC3）的表达。4、流式细胞术 Annexin/PI双染法检测未诱导的ADSCs及诱导后48h、7d、14d、21d时细胞的生存状态。5、透射电子显微镜下观察诱导后14d的星形胶质细胞线粒体超微结构、凋亡及自噬现象。6、MTT法检测 ADSCs诱导分化为星形胶质细胞过程中细胞的生长状态。7、统计学方法：所得实验数据应用 Excel2003数据库整理，采用统计软件包 SPSS17.0进行分析，数据均以（(x)±s）表示，不同时间点间的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。　　结果：1、提取的原代 ADSCs于24h时已贴壁，倒置相差显微镜下可见细胞呈三角形、短梭形。培养至7~10d时可见大量呈漩涡状排列的长梭形细胞。2、诱导反应48h时，细胞折光性增强，部分细胞的胞体周围伸出细长突起，并有多个分支。诱导反应7d时，细胞胞体折光性显著增强，部分细胞呈现典型的星形胶质细胞形态，并交织成网状。诱导14d时，细胞胞体折光性较7d时更加增强，但细胞形态与7d时无明显变化。诱导21d时，细胞数量减少，细胞的突起较诱导14d时变短、变少。3、免疫细胞化学结果显示GFAP在未诱导的ADSCs中无阳性表达，而在诱导后各时间点均可见阳性表达细胞，且在细胞体和突起部位的细胞质均呈阳性表达，GFAP的细胞阳性表达率仅7d与14d无统计学差异（P＞0.05），至诱导7d时GFAP的阳性表达率达到高峰（P＜0.05）。Bax、Bcl-2、Cyt-c、Caspase-3和LC3在未诱导的ADSCs和诱导反应的各时间点均可见阳性表达，而且阳性表达部位主要位于细胞核周围的细胞浆，而突起部位没有见到明显的阳性表达。Bcl-2的阳性表达率随着诱导时间的延长逐渐降低（P＜0.05），在未诱导的ADSCs和诱导后各时间点仅7d与14d无统计学差异（P＞0.05）。Bax、Cyt-c、Caspase-3、LC3的阳性表达率在未诱导的ADSCs和诱导后48h、7d、14d、21d之间均有明显统计学差异（P均＜0.01），至诱导14d时 Bax、Cyt-c、Caspase-3、LC3的阳性表达率均达到高峰（P均＜0.05）。4、Western-blotting结果显示，GFAP在未诱导组的ADSCs中无表达，随诱导时间的延长其表达量增加，至7d时达到高峰（P＜0.05）。Bcl-2的表达水平随着诱导时间的延长逐渐降低（P＜0.05）。LC3Ⅰ的表达随诱导时间的延长，逐渐降低（P＜0.05）。Bax、Cyt-c、Caspase-3及LC3Ⅱ的表达水平均逐渐增加，至诱导14d达到高峰（P均＜0.05）。5、透射电子显微镜下可见到线粒体的超微结构，凋亡小体结构及自噬现象。6、流式细胞术的检测结果显示，诱导反应过程中的细胞存活率随着诱导时间的延长逐渐下降，早期凋亡率、晚期凋亡或坏死率随着诱导时间的延长逐渐升高。7、MTT的结果显示，随着诱导时间的延长，细胞的存活数量逐渐下降。　　结论：1、ADSCs在应用以IBMX为主要成分的诱导剂诱导分化为星形胶质细胞的第7~14d时处于最佳的存活和分化状态，此时可以终止反应，并对于所得的细胞进行筛选分离和保存，以便于进行相关的应用和研究。2、在正常 ADSCs中，经线粒体信号传导途径产生的凋亡和自噬反应较弱。3、在ADSCs诱导分化为星形胶质细胞的过程中，线粒体凋亡和细胞自噬反应明显增强，但自噬反应不足以清除全部受损的线粒体，从而引发线粒体途径介导的细胞凋亡。

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引言

第1章 实验研究

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

1.1.2 实验方法

1.2 结果

1.2.1 成人ADSCs原代及传代培养的细胞的形态学特征

1.2.2 GFAP/Bax/Bcl-2/Cyt-c/Caspase3/LC3的免疫细胞化学检测结果

1.2.3 GFAP/Bax/Bcl-2/Cyt-c/Caspase3/LC3的Western-blotting结果

1.2.4 线粒体超微结构及凋亡与自噬的变化特征

1.2.5 细胞生存状态的流式细胞术检测结果

1.2.6 细胞生长状态的MTT法检测结果

1.3 讨论

1.4 结论

参考文献

第2章 综 述自噬与线粒体自噬

2.1 自噬的简介及发生过程

2.2 自噬的分子机制及其调节

2.3 线粒体自噬

2.3.1 线粒体的动态变化

2.3.2 线粒体自噬的途径

2.3.3 PINK1/Parkin 介导的线粒体大自噬途径

2.3.4 Nix介导的线粒体大自噬途径

2.4 线粒体自噬与疾病

参考文献

致谢

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