VPA及其代谢产物血药浓度RP-HPLC分析方法建立及与CYP2C9*3相关性的初探

摘要

目的：建立同时测定丙戊酸钠(Sodium Valproate，VPA)及其代谢产物2-ene-VPA(2-Propyl-2-pentenoic Acid,2-ene-VPA)和4-ene-VPA(2-Propyl-4-pente-noic Acid,4-ene-VPA)血药浓度的反相高效液相色谱法(Reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)，分析服药剂量与 VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA血药浓度的关系，探讨性别对VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA血药浓度的影响，细胞色素 P4502C9(CYP2C9)基因多态性与 VPA和4-ene-VPA血药浓度的关系，为丙戊酸钠个体化用药提供参考。　　方法：选择确诊为癫痫且单药服用丙戊酸钠治疗，无肝功能异常和器质性病变的18岁以下癫痫患者，每天定时服用VPA，血药浓度达稳态后，于清晨服药前抽取患者静脉血2 mL进行以下检测：(1)建立反相高效液相色谱法测定丙戊酸钠与2-ene-VPA和4-ene-VPA的血药浓度。血浆以正辛酸为内标，用硫酸酸化，正己烷提取，氮气挥干样品，乙腈复溶，2,4'-二溴苯乙酮作为衍生化试剂，三乙胺催化，在80℃水浴衍生化30 min；色谱柱：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5μm)，紫外检测波长：258 nm，流动相：乙腈-甲醇-水＝59:13:28，流速：1.0 mL?min-1，柱温：35℃；(2)用血液直接 PCR方法检测74名患儿 CYP2C9基因型；(3)分析VPA服药剂量、性别对VPA、2-ene-VPA及4-ene-VPA血药浓度的影响，CYP2C9基因型与 VPA及4-ene-VPA血药浓度的关系；(4)统计学方法：计量资料用-χ±S表示，运用SPSS20.0统计软件对 VPA服药剂量与 VPA、2-ene-VPA及4-ene-VPA血药浓度之间的关系，VPA血药浓度与2-ene-VPA和4-ene-VPA血药浓度之间的关系进行相关性分析，采用独立样本t检验探讨性别对VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA血药浓度的影响，CYP2C9基因型与 VPA和4-ene-VPA血药浓度的关系。　　结果：(1)VPA、2-ene-VPA及4-ene-VPA的RP-HPLC分析方法：VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA和内标正辛酸的保留时间分别为11.6 min、9.4 min、8.6 min和12.4 min；VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA与内标正辛酸的峰面积比与浓度呈良好的线性关系，VPA浓度范围为5.00~200.00μg?mL-1，yVPA=0.2169 xVPA＋0.6286(r=0.9995，n=5);2-ene-VPA浓度范围为0.50~16.00μg?mL-1，y2-ene-VPA=0.3206 x2-ene-VPA＋0.1041(r=0.9991，n=5)；4-ene-VPA浓度范围为0.50~16.00μg?mL-1，y4-ene-VPA=0.4357 x4-ene-VPA＋0.3531(r=0.9996，n=5)，最低定量限分别为5.00μg?mL-1，0.50μg?mL-1和0.50μg?mL-1(S/N>5)；VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA低、中、高3个浓度血浆质控样品的平均提取回收率分别为 VPA74.60%、81.44%、81.97%，2-ene-VPA76.82%、83.26%、78.57%，4-ene-VPA79.46%、83.26%、79.36%，日内 RSD<5%，日间RSD<5%，稳定性RSD<5%；(2) CYP2C9目的基因条带大小为315 bp，野生型CYP2C9*1和突变型 CYP2C9*3等位基因频率分别为95.25%和4.75%，野生型纯合子(CYP2C9*1/*1)和突变型杂合子(CYP2C9*1/*3)基因型频率分别为90.5%和9.5%；(3)纳入0~17岁的癫痫患儿74例，平均年龄(6.5±4.1)岁，VPA平均给药剂量(18.34±5.86) mg?kg-1；(4)VPA给药剂量与VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA血药浓度之间的关系：VPA给药剂量与 VPA血药浓度相关性具有统计学意义(P<0.05，R=0.330)，与2-ene-VPA、4-ene-VPA血药浓度相关性无统计学意义(P=0.175，R=0.160)，(P=0.131，R=0.186);(5)性别对 VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA血药浓度的影响：①服用VPA的74例癫痫患儿中，男性与女性VPA给药剂量分别为(18.01±5.58) mg?kg-1和(19.02±6.18) mg?kg-1，二组间给药剂量差异不具有统计学意义(P=0.505)，②癫痫患儿 VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA血药浓度分别为男性(70.15±24.79)μg?mL-1、(3.56±1.51)μg?mL-1、(1.07±0.40)μg?mL-1,女性(76.23±23.61)μg?mL-1、(3.39±1.70)μg?mL-1、(1.08±0.39)μg?mL-1,男女之间血药浓度相比差异不具有统计学意义(P=0.346)，(P=0.682)，(P=0.970)；(6)基因型对 VPA和4-ene-VPA血药浓度的影响：① A组(CYP2C9*1/*1)和 B组(CYP2C9*1/*3)给药剂量分别为(17.89±5.66) mg?kg-1和(22.12±5.15) mg?kg-1，两组给药剂量差异不具有统计学意义(P=0.062)；②A组和B组VPA血药浓度分别为(70.94±25.28)μg?mL-1和(79.93±12.94)μg?mL-1，两组血药浓度差异不具有统计学意义(P=0.359)；③4-ene-VPA血药浓度分别为(1.11±0.39)μg?mL-1和(0.76±0.29)μg?mL-1，两组血药浓度差异具有统计学意义(P=0.025)。　　结论：(1)本课题建立了同时测定VPA及其代谢产物2-ene-VPA和4-ene-VPA血药浓度的RP-HPLC分析方法，可用于临床上癫痫患者服用VPA后测定血药浓度，以分析药物的疗效和不良反应。(2) CYP2C9*1/*3表型使CYP2C9的酶活性降低，影响丙戊酸钠的代谢，是影响疗效和不良反应的一个重要因素，为临床个体化用药提供参考。

目录

声明

英文缩略词表

0引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.1 方法学考察

2.2 PCR产物凝胶电泳与测序

2.3 临床应用

3讨论

3.1 同时测定VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA血药浓度分析方法的建立

3.2 测定癫痫患儿VPA及其代谢物血药浓度的研究

3.3 CYP2C9*3等位基因对VPA和4-ene-VPA血药浓度的影响

4 结论

参考文献

附录

综述:丙戊酸钠及其代谢产物4-ene-VPA和2-ene-VPA肝毒性研究进展

作者简介

致谢

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