新型丙型肝炎病毒重组体在Huh7细胞系中复制研究

摘要

目的：　　丙型肝炎病毒（HCV）是一个全长9.6kb的单链正义RNA病毒。HCV于1989年被发现，但是体外培育一直很困难。Blight等人在2003年用IFN-β预处理了含有Con1复制子的Huh7的细胞，得到了低分泌IFN-β的细胞，即Huh7.5细胞。2011年，Li等人建立了J6/JFH1重组体，该重组体能在Huh7.5细胞中产生大量的病毒颗粒。目前关于HCV重组体J6/JFH1的研究都是在Huh7.5细胞基础上进行的。本实验就是研究HCV全长基因型J6/JFH1能否转染至Huh7细胞，观察J6/JFH1能否在Huh7细胞内复制，并通过感染新的健康的Huh7细胞来确定能否产生感染性病毒颗粒。通过测定滴度明确病毒感染力，旨在通过J6/JFH1在Huh7细胞内生长，得到耐IFN-β的新型J6/JFH1病毒，为HCV耐IFN的研究提供理论依据，并为今后临床耐IFN的丙肝治疗提供新思路。　　方法：　　实验分为Huh7细胞与Huh7.5细胞组。将HCV重组体J6/JFH1 RNA转染至Huh7和Huh7.5细胞中，利用荧光显微镜观察HCV阳性细胞数，待HCV阳性细胞达80％左右，分别收集两组细胞产出的病毒，连续收集三次。然后将Huh7细胞产出的病毒感染新的Huh7细胞，得到的病毒命名为一代病毒。取一代病毒感染新的Huh7细胞，待HCV阳性细胞率达80%左右的时候收集上清液。并用此次感染收集的病毒感染新的Huh7细胞，得到的病毒命名为二代病毒，测定转染Huh7细胞及Huh7.5细胞与2次感染收集病毒的滴度。　　结果：　　在将HCV RNA转染和活病毒感染Huh7细胞后，HCV重组体J6/JFH1能顺利在Huh7细胞内复制，并能感染新的Huh7细胞。说明该病毒能产生感染性病毒颗粒。通过荧光显微镜观察，HCV阳性细胞达80%的时间分别是第13天、第7天及第5天。而观察 Huh7.5细胞组，HCV阳性细胞达80%的时间为3天。对比Huh7细胞组及Huh7.5细胞组，该时间在逐渐缩短，第二次感染时间接近于Huh7.5,细胞组。在转染至Huh7细胞与Huh7.5细胞及2次感染Huh7细胞时，Huh7.5细胞组最高滴度为104.4±0.05FFU/ml。Huh7细胞组转染及2次感染的最高滴度分别是103.5±0.05FFU/ml，第一次感染的最高病毒滴度为104.3±0.06FFU/ml，第二次感染的最高病毒滴度为104.4±0.05FFU/ml。　　结论：　　成功在Huh7细胞内培育出了新型J6/JFH1病毒，命名为J6/JFH1Huh7。该病毒滴度高，与Huh7.5细胞内产出病毒滴度相当，适合用于HCV下一阶段的药物筛选。本实验为HCV体外培育提供了新思路，为耐IFN的丙肝治疗奠定了一定的基础。为HCV的药物筛选及疫苗等研究提供了良好的实验模型，对于HCV的发病机制提供了研究的工具，为进一步深入研究积累了数据。

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英文缩略词表

0 引 言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2试剂

1.2方法

2 结 果

2.1 J6/JFH1质粒线性化结果

2.2 HCV RNA体外转录的结果

2.3 HCV RNA转染至Huh7细胞与感染Huh7细胞结果

2.4 Huh7细胞与Huh7.5细胞转染效率与时间对比

2.5 HCV重组体J6/JFH1转染及感染Huh7细胞时间变化对比

2.6 HCV J6/JFH1在两组细胞内各期活病毒滴度测定

3.讨论

3.1 两组细胞HCV阳性细胞达80%的影响因素分析

3.2 Huh7细胞组转染及2次感染HCV阳性细胞阳性率达80%时间分析

3.3 新型病毒突变对于Huh7.5细胞无特异性

3.4 两组细胞病毒滴度结果影响分析

3.5 Huh7细胞产出的转染和感染期病毒滴度影响分析

4. 结论

参考文献

综述：HCV体外细胞复制系统及动物模型

作者简历

致谢

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