RabGTPases参与了BLP耐受巨噬细胞对细菌清除能力增强的过程

摘要

目的：细菌脂蛋白（bacterial lipoprotein，BLP）是革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌外膜中最丰富的蛋白，主要由生长或裂解的细菌释放。研究表明机体（细胞）经过小剂量BLP预处理后，再次给予致死剂量的BLP刺激，机体（细胞）表现为炎症因子释放减少，死亡率降低，这种现象称为BLP耐受。BLP耐受是动物在长期进化过程中形成的一种保护性的机制，目前，对这一机制尚不清楚。在机体（细胞）对 BLP的耐受过程中，突出的表现是机体（细胞）对细菌的清除能力增强。细胞对细菌的清除过程包括吞噬病原微生物和吞噬体与溶酶体融合形成吞噬溶酶体两部分，其中Rab GTPases是参与吞噬体成熟以及运输病原体这一过程的重要分子。本课题的目的是探讨Rab GTPases是否参与了细菌脂蛋白（BLP）耐受后骨髓诱导分化的巨噬细胞（BMDMs）杀菌能力增强的过程。　　方法：选取健康清洁级体重18-20g的雄性C57BL/6小鼠分离其股骨和胫骨，并获得骨髓，用L929细胞培养上清诱导骨髓中细胞定向分化成巨噬细胞，7天成熟后，制备成非耐受组（Naive）组和BLP耐受的BMDMs。接下来首先用转染了绿色荧光蛋白的大肠杆菌（GFP-E.coli）分别感染Naive组和BLP耐受的BMDMs15、30分钟，用流式细胞仪检测吞噬了GFP-E.coli的阳性细胞百分数，观察细胞对细菌的吞噬能力；然后用大肠杆菌感染两组细胞30、60分钟，涂板计数菌落数量，观察细胞对细菌的杀灭能力；其次利用定量PCR比较了BLP耐受BMDMs和Naive BMDMs中Rab5a、Rab5b、Rab7、Rab9、Rab9b、Rab11a、Rab11b、Rab12、Rab14、Rab20、Rab32、Rab34这12种Rab分子的mRNA表达变化，筛选出水平升高的Rab7以及Rab20分子；接下来在不同时间点用热灭活的大肠杆菌感染Na?ve和BLP耐受的BMDMs，用定量PCR和Western blot证实Rab7分子以及Rab20分子的mRNA和蛋白表达在BLP耐受的BMDMs中的变化，发现高于Na?ve组；最后用RNAi技术分别下调BLP耐受巨噬细胞Rab7分子以及Rab20分子表达，用转染了绿色荧光蛋白的大肠杆菌（GFP-E.coli）分别感染干扰组和非干扰组的细胞15、30分钟，用流式细胞仪检测吞噬了GFP-E.coli的阳性细胞百分数，观察细胞对细菌的吞噬能力；用大肠杆菌感染干扰组和非干扰组细胞30、60分钟，裂解细胞涂板计数细菌菌落数量，观察细胞对细菌的杀灭能力。　　结果：吞菌实验显示BLP耐受的BMDMs在15分钟时吞噬细菌数量（25.7±1.7％）比Na?ve组（13.8±1.7%）显著增加(P<0.05)，30分钟时吞噬细菌数量（75.1±0.1%）也比Na?ve组（39.8±5.4%）显著增加(P<0.05)；杀菌实验显示，30分钟时，BLP耐受的BMDMs杀灭大肠杆菌的百分比在为Na?ve的1.7倍(P<0.05)，60min时为Na?ve的1.6倍(P<0.05)；检测的12个Rab分子中，Rab7分子和Rab20分子在BLP耐受BMDMs的mRNA水平升高，Rab7分子在BLP耐受细胞中是非耐受细胞的1.4倍(P<0.05)，Rab20在耐受BMDMs中是不耐受的2倍(P<0.05)；进一步用定量PCR和Western blot证实Rab7和Rab20分子的mRNA和蛋白表达在BLP耐受细胞感染大肠杆菌后，随着时间延长均明显升高；分别下调Rab7和Rab20的表达，不影响BLP耐受巨噬细胞对细菌的吞噬能力；但是下调Rab7，30分钟时非干扰组是干扰组杀菌量的1.6倍(P<0.05)，60分钟时非干扰组是干扰组的1.3倍(P<0.05)；下调Rab20，30、60分钟时非干扰组均为干扰组杀菌量的1.3倍(P<0.05)。　　结论：　　1.BLP耐受后BMDMs清除细菌的能力增加；　　2.感染热灭活的大肠杆菌后，BLP耐受的BMDMs中Rab7和Rab20的表达持续增强；　　3.分别下调Rab7或Rab20的表达，BLP耐受的BMDMs对吞噬能力并无影响，但对细菌的杀灭能力明显减弱。综上所述，BLP耐受后巨噬细胞细胞通过分别上调Rab7和Rab20分子的表达水平，从而增强巨噬细胞对细菌的清除能力。

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0 引 言

1. 材料与方法

1.材料

2. 方法

2 结 果

2.1 Naive和BLP耐受BMDMs对细菌吞噬能力和杀灭能力的比较

2.2 Rab分子在BLP耐受BMDMs中的表达

2.3 E.coli刺激对Rab7的mRNA与蛋白表达的影响

2.4 下调Rab7的表达对BLP耐受细胞细菌吞噬能力影响

2.5 下调Rab7的表达对BLP耐受细胞细菌杀灭能力的影响

2.6 E.coli刺激对Rab20的mRNA与蛋白表达的影响

2.7 下调Rab20的表达对BLP耐受细胞细菌吞噬能力影响

2.8 下调Rab20的表达对BLP耐受细胞细菌杀灭能力的影响

3 讨 论

4 结论

参考文献

附录 实验数据统计表

综述：Rab GTPases 研究进展

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致谢

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