拟水龟属物种鉴别及龟灵颗粒保健食品的初步研究

摘要

目的：　　对拟水龟属物种（黄喉拟水龟Mauremys mutica(Cantor)、乌龟 M. reevesii (Gray)、黑颈乌龟M. nigricans (Gray)、花龟M. sinensis (Gray)） 及黄喉拟水龟 M. mutica (Cantor)的地方种—广西拟水龟M. guangxiensis（cen））进行鉴别，为拟水龟属物种鉴别提供科学依据。此外选择乌龟龟甲和广西拟水龟龟甲分别配以灵芝进行有效部位提取工艺、处方工艺、颗粒质量标准等研究，为后期开发龟灵颗粒保健食品打下基础。　　方法：　　1.对拟水龟属物种及广西拟水龟进行鉴别，主要包括文献考证、来源鉴别、性状鉴别（观察比较龟甲颜色、脊棱、盾片、色斑等特征）、显微鉴别（观察比较龟甲粉末颜色、骨碎片、角质板等特征）以及采用2015年版《中国药典》一部方法，测定比较龟甲粉末氨基酸含量。　　2.采用传统提取工艺比较乌龟龟甲胶和广西拟水龟龟甲胶得率；以龟甲胶得率为目标，采用水提工艺，以提取次数、提取时间、用水量为主要影响因素，设计正交实验，研究广西拟水龟龟甲胶最佳提取工艺。优化乌龟龟甲胶和广西拟水龟龟甲胶提取工艺，并进行重现性研究。　　3.以灵芝粗多糖为目标提取物，采用水提醇沉工艺，以提取次数、广时间、加水量为主要影响因素，设计正交实验，根据灵芝粗多糖得率，确定灵芝粗多糖最佳提取工艺，并进行重现性研究。　　4.以溶化性为指标，通过工艺选择、稀释剂种类用量、粒度筛选，研究速溶龟甲颗粒处方工艺。在速溶龟甲颗粒处方工艺确定基础上，通过预实验，筛选处方稀释剂和粘合剂，最后进行DOE设计，筛选出龟灵颗粒的处方工艺研究。　　5.根据设计的处方工艺，分别用乌龟龟甲和广西拟水龟龟甲进行龟灵颗粒保健食品的制备，根据2015年版《中国药典》四部通则 0104 颗粒剂项下要求，进行产品性状、粒度、水分、溶解性检查，初步建立龟灵颗粒质量标准。　　结果：　　1.通过文献考证，古书记载的龟甲原动物并非仅指乌龟一种，而是以乌龟属和拟水龟属为主的多种龟。通过原动物来源鉴别，经广西壮族自治区水产科学研究院张益峰高级工程师鉴定，分别为:黄喉拟水龟Mauremys mutica(Cantor)、乌龟M.reevesii(Gray)、黑颈乌龟M.nigricans (Gray)、花龟M. sinensis(Gray)以及黄喉拟水龟M.mutica(Cantor)地方品种的广西拟水龟M. guangxiensis（cen）的原动物。通过性状鉴别，发现拟水龟属物种及广西拟水龟在眼线、颈部条纹、身体四肢纹路、体色、背甲形状、腹甲色斑等方面有明显特征；通过对拟水龟属物种及广西拟水龟背甲、腹甲颜色、背脊数量、盾片大小、色斑有无等进行性状鉴别，发现拟水龟属物种及广西拟水龟有明显鉴别特征；通过龟甲粉末显微鉴别，发现拟水龟属物种及广西拟水龟在于骨碎片、角质板、色素点的性状、大小及颜色等方面有鉴别特征；按2015版中国药典一部质量标准，对乌龟、黄喉拟水龟、花龟、广西拟水龟的龟甲粉末进行氨基酸含量测定，结果药典规定 4 种氨基酸含量均达到规定限度，符合规定。其中甘氨酸含量比较项下，乌龟＞广西拟水龟＞黄喉拟水龟＞花龟；丙氨酸含量比较项下，乌龟＞广西拟水龟＞花龟＞黄喉拟水龟；L-羟脯氨酸含量比较项下，乌龟＞黄喉拟水龟＞广西拟水龟＞花龟；L-脯氨酸含量比较项下，黄喉拟水龟＞乌龟＞广西拟水龟＞花龟。　　2.龟甲胶提取工艺研究结果表明，在设计的正交试验因素中，影响龟甲胶得率的最主要因素为提取时间，其次为提取次数，最次为提取用水量。龟甲胶最佳提取工艺为：提取4次，每次5小时，用水量为8倍。广西拟水龟龟甲胶与乌龟龟甲胶得率相比（传统提取工艺和正交实验确定工艺），乌龟龟甲胶得率均略高于广西拟水龟龟甲胶得率。确定的提取工艺重现性好。正交实验确定工艺与传统提取工艺相比，大大缩短提取时间，提高提取效率。　　3.灵芝粗多糖提取工艺研究结果表明，在设计的正交试验因素中，影响灵芝粗多糖提取得率的最主要因素为提取次数，其次为提取时间，最次为提取用水量。灵芝粗多糖最优提取工艺为：提取 3 次，每次 1.5h，用水量18倍。确定的提取工艺重现性好。　　4.通过处方工艺研究，冻干工艺及稀释剂分散制粒工艺均能解决龟甲胶不易溶、人体生物利用度低、服用不方便等问题。其中冻干工艺赋形剂采用5%甘露醇，冻干成型性好，溶解完全；稀释剂分散制粒工艺，采用处方量龟甲胶的2倍量甘露醇和0.3倍量胶态二氧化硅分散制粒，颗粒磨粉过80目筛，龟甲颗粒在1分钟左右溶化完全。考虑到产业化的生产成本及工艺简单、可行性，选择稀释剂分散制粒工艺速溶龟甲颗粒。在龟甲颗粒溶化性问题解决基础上，通过处方筛选研究，龟灵颗粒优选甘露醇：蔗糖=1:1作为稀释剂，10%PVP75%乙醇溶液作粘合剂。在预实验基础上，以龟灵颗粒的溶化性、流动性、粒度为关键质量属性，进行处方空间的DOE设计，评估稀释剂用量、粘合剂用量、硬脂酸镁用量对龟灵颗粒关键质量属性的影响，结果在设计的处方空间范围内，影响龟灵颗粒综合质量的最主要因素是硬脂酸镁用量，其次依次是粘合剂用量、稀释剂用量。稀释剂用量为 36%，粘合剂用量为 28%，硬脂酸镁用量为1%的处方组成最优。对龟灵颗粒溶化性影响最大的因素为硬脂酸镁用量，其次为粘合剂用量，最小为稀释剂用量；对龟灵颗粒流动性影响最大的因素为粘合剂用量，其次为硬脂酸镁用量，最小为稀释剂用量；对龟灵颗粒粒度影响最大的因素为粘合剂用量，其次为硬脂酸镁用量，最小为稀释剂用量。此外，矫味剂及用量的筛选以选用0.5%阿斯巴甜和0.3%甜橙香精组合物为佳，能较好地掩盖本品的苦涩味道。　　5.根据设计的处方工艺，分别用乌龟龟甲胶和广西拟水龟龟甲胶配以灵芝粗多糖进行各3批龟灵颗粒保健食品制备，采用2015年版《中国药典》四部通则 0104 颗粒剂项下要求，进行性状、粒度、水分、溶解性检查，各批样品质量均符合质量标准规定。　　结论：　　（1）本研究首次通过对拟水龟属的黄喉拟水龟 Mauremys mutica (Cantor)、乌龟 M. reevesii (Gray)、黑颈乌龟M. nigricans (Gray)、花龟M. sinensis(Gray)以及黄喉拟水龟M.mutica(Cantor)地方品种—广西拟水龟M. guangxiensis（cen）进行文献考证、来源鉴别、性状鉴别、显微鉴别及理化鉴别研究，建立了拟水龟属物种鉴别方法，为龟灵颗粒保健食品原料鉴别提供科学依据；（2）通过广西拟水龟、乌龟提取工艺及灵芝提取工艺进行研究，确定药材提取工艺，为龟灵颗粒保健食品原料提取提供最佳工艺；（3）通过对龟甲胶速溶处方工艺摸索、龟灵颗粒处方工艺研究，筛选出龟灵颗粒最优化处方工艺；（4）用广西拟水龟龟甲胶、乌龟龟甲胶分别配以灵芝粗多糖，各制备 3 批龟灵颗粒，对颗粒剂进行外观、粒度、水分、溶化性的检测，初步建立起本品质量控制标准。　　本论文研究内容经科技查新证实，目前尚未见与上述特点相同的文献报道。

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