HIV-1感染者PBMCs、CD3+T细胞、CD8+T细胞PD-1表达对PLC-γ和PKC-θ磷酸化水平的影响研究

摘要

目的：分别检测人类免疫缺陷病毒-1（human immunodeficiency virus-1, HIV-1）感染者外周血单个核细胞（peripher alblood mononuclear cells,PBMCs）、CD3+T细胞、CD8+T细胞上程序性死亡因子1（programmed death1,PD-1）、磷酸化磷脂酶C-γ(phospholipaseC-γ,PLC-γ)和磷酸化蛋白激酶C-θ(protein kinaseC,PKC-θ)表达，寻找HIV-1感染过程中PBMCs、CD3+T细胞、CD8+T细胞上PD-1的表达与pPLC-γ和pPKC-θ磷酸化水平的相关性，探讨HIV-1感染过程中PD-1表达对pPLC-γ、pPKC-θ的影响规律。　　方法：　　1.根据中国卫生行业艾滋病感染诊断标准（WS293-2008），于2015年3月至2016年12月期间在广西壮族自治区疾病预防控制中心和广西横县疾病预防控制中心收集收集HIV-1感染者外周血42例。根据CD4计数值将感染者分为典型进展者（typical progressors,TPs）28例和慢性HIV-1感染者（chronic HIV-1 infected persons,CPs）14例（以上人群的纳入标准：TP s，指感染至纳入研究时间不超过10年、C D4+T细胞计数<350/μl、未接受抗病毒治疗者）；CPs，指350/μl≤C D4+T细胞计数、未接受抗病毒治疗者；阴性对照组为健康捐赠者（healthy donors, HDs），共14例。所有被研究者排除乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）合并感染的可能。2.清晨空腹取静脉外周血，密度梯度离心法分离 P BMC s；3.用抗人单克隆荧光抗体标记PBMCs上CD3、CD8、PD-1分子，加入纯化CD3和纯化CD28刺激，经固定破膜后用抗人单克隆荧光抗体标记磷酸化P LC-γ和P KC-θ分子；4.调整流式细胞仪电压，圈出PBMCs群并检测PBMCs、CD3+T细胞、CD8+T细胞上PD-1、pPLC-γ和pPKC-θ分子的表达水平；5.采用GraphPad Prism5.0统计软件进行分析与处理。用Wilcoxon非配对检验比较TPs组、CPs组与HDs组样本中PD-1、磷酸化PLC-γ和磷酸化PKC-θ表达水平的差别，以P<0.05为差异具有统计学意义；采用Spearman相关性检测同一样本P D-1、pP LC-γ和pP KC-θ表达水平的相关性，以P<0.05表示两参数间具有相关关系，以R值表示相关系数。　　结果：　　1.HIV-1感染过程中PBMCs上PD-1、磷酸化PLC-γ、磷酸化PKC-θ表达水平：TPs组PBMCs上PD-1的表达高于CPs组和HDs组（P＜0.05，P＜0.05），CPs组P BMCs上P D-1的表达高于HDs组（P＜0.05）；T Ps组和C Ps组P BMCs上p P LC-γ的表达均高于HDs组（P＜0.05）；T Ps组P BMCs上pP KC-θ的表达低于CPs组和HDs组（P＜0.05，P＜0.05）， CPs组PBMCs上pPKC-θ的表达低于HDs组（P＜0.05）；HIV-1感染过程中CD4计数与PBMCs上PD-1负相关（P＜0.05），与pPKC-θ正相关（P＜0.05）；HIV-1感染过程中PBMCs上PD-1与pPKC-θ的表达呈负相关（P＜0.05）。　　2. HIV-1感染过程中 C D3+T细胞上 P D-1、磷酸化 P LC-γ、磷酸化PKC-θ表达水平：TPs组CD3+T细胞上PD-1的表达显著高于CPs组和HDs组（P＜0.05，P＜0.05），CPs组PBMCs上PD-1的表达显著高于HDs组（P＜0.05）；TPs组和CPs组CD3+T细胞上pPLC-γ的表达均高于HDs组（P＜0.05）；TPs组CD3+T细胞上pPKC-θ的表达低于CPs组和HDs组（P＜0.05，P＜0.05），CPs组CD3+T细胞上pPKC-θ的表达低于HDs组（P＜0.05）；HIV-1感染过程中CD4计数与CD3+T细胞上PD-1负相关（P＜0.05）；与pPKC-θ正相关（P＜0.05）；HIV-1感染过程中C D3+T细胞上P D-1与pP KC-θ之间的表达呈负相关（P＜0.05）。　　3.HIV-1感染过程中 CD8+T细胞上 PD-1、磷酸化 PLC-γ、磷酸化PKC-θ表达水平：TPs组CD8+T细胞上PD-1的表达显著高于CPs组和HDs组（P＜0.05，P＜0.05），CPs组PBMCs上PD-1的表达显著高于HDs组（P＜0.05）；TPs组和CPs组CD3+T细胞上pPLC-γ的表达均高于HDs组（P＜0.05）；TPs组CD8+T细胞上pPKC-θ的表达低于CPs组和HDs组（P＜0.05，P＜0.05），CPs组CD8+T细胞上pPKC-θ的表达低于HDs组（P＜0.05）；HIV-1感染过程中CD4计数与CD8+T细胞上PD-1负相关（P＜0.05），与pPKC-θ正相关（P＜0.05）；HIV-1感染过程中C D8+T细胞上P D-1与pP KC-θ之间的表达呈负相关（P＜0.05）。　　结论：　　本研究表明HIV-1感染过程中PBMCs、CD3+T细胞、CD8+T细胞PD-1的表达水平显著升高，PKC-θ磷酸化水显著降低并与HIV-1病程相关；PD-1可能通过参与调控PKC-θ的磷酸化水平影响免疫细胞的活化与效应功能；作为PKC-θ的信号上游分子，PLC-γ的表达升高且与PD-1不存在相关性，提示在HIV-1病程中，可能尚有其他途径影响TCR-CD3信号通路信号分子PLC-γ的磷酸化水平。

目录

声明

引言

第一部分 PD-1表达对PBMCs细胞PLC-γ和PKC-θ磷酸化水平的影响研究

一、资料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

第二部分 PD-1表达对CD3+T细胞PLC-γ和PKC-θ磷酸化水平的影响研究

一、资料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

第三部分 PD-1表达对CD8+T细胞PLC-γ和PKC-θ磷酸化水平的影响研究

一、资料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

全文总结

参考文献

附录

综述: 蛋白激酶C-θ在HIV-1感染中的进展研究

致谢

个人简历及攻读学位期间获得的科研成果