二醇基修饰磁性壳聚糖微球的制备与应用

摘要

天然产物中存在多种丰度很低的小分子蛋白，为维持生命体的正常运行发挥重要作用。固定化金属亲和层析法因其特异性吸附功能而备受青睐，但杂蛋白会与目标小分子竞争亲和介质的吸附位点，降低亲和分离的选择性。为削弱杂蛋白对吸附位点的竞争，本课题使用二醇基修饰固定化金属亲和介质，以更好地排阻杂蛋白，增强吸附活性小分子。为避免因载体均一度不佳而影响应用，本课题采用膜乳化-原位法制备出均匀的亲和载体。　　结果如下:　　(1)以膜乳化法制备壳聚糖微球，在乙酸含量3％、乳化剂含量4％、乳化压力200kPa、转速400 r·min-1、交联剂2mL及固化溶液pH值为7.5的条件下，可得到平均粒径为5.95μm，粒径分布系数为0.37的壳聚糖微球。再结合原位法，当壳聚糖与FeCl2·4H2O的质量比为1∶1时，可得到磁饱和强度为25.69 emu·g-1的均匀磁性壳聚糖微球(M-CS)。　　(2)用环氧氯丙烷(ECH)来活化载体(M-CS)，在45℃、ECH体积分数为50％、NaOH浓度为0.6 mol·L-1及反应6h的条件下，所得环氧基密度最高，为189.72μmol·g-1。再以IDA为螯合剂，制备出磁性固定化Cu2+亲和介质(M-CS@Cu2+)，并优化该介质吸附牛血清蛋白(BSA)的条件:当BSA浓度为1.0mg·mL-1时，在0.01 mol·L-1的PBS缓冲液pH为6.8，35℃吸附1.5h的条件下，M-CS@Cu2+对BSA的吸附量最大，为123.27mg·g-1。同时发现可用Freundlich方程来描述M-CS@Cu2+对BSA的吸附，且该吸附符合伪二级动力学模型。　　(3)通过控制IDA的用量来分配环氧基的反应路径，在M-CS@Cu2+的基础上制备出二醇基修饰的亲和介质(M-CS@Cu2+@OH)。以VSLPEW为活性小分子模型，BSA为大分子蛋白模型，比较M-CS、M-CS@Cu2+和M-CS@Cu2+@OH对BSA与VSLPEW的混合体系的吸附，发现M-CS@Cu2+@OH存在更好的特异性吸附效果，可把VSLPEW的含量由0.99％富集到4.66％。用pH为5.0，2.0 mol·L-1的NaCl溶液洗脱介质三次，每次25min，且介质在重复使用三次后效果变差，再生后吸附能力基本稳定。以酪蛋白酶解液来模拟实际体系，通过比较M-CS、M-CS@Cu2+和M-CS@Cu2+@OH对酶解液的吸附及活性检测，发现被M-CS@Cu2+@OH吸附的蛋白具有更高的活性。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 固定化金属亲和层析

1．2．1 固定化金属亲和层析技术的概述

1．2．2 固定化金属亲和层析介质的构成

1．2．3 IMAC吸附蛋白的机理

1．2．4 固定化金属磁性微球亲和载体

1．3 磁性高分子微球的制备

1．3．1 传统磁性微球的制备方法

1．3．2 膜乳化技术的介绍

1．4 磁性亲和层析介质的表面修饰

1．5 论文选题意义

1．6 论文研究内容

第二章 膜乳化-原位法制备磁性壳聚糖微球

2．1 引言

2．2 试剂与仪器

2．2．1 原料与试剂

2．2．2 仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 壳聚糖微球的制备

2．3．2 磁性壳聚糖微球的制备

2．3．3 样品的表征

2．4 结果与讨论

2．4．1 壳聚糖微球的制备工艺研究

2．4．2 原位法制备磁性微球

2．4．3 磁性壳聚糖微球表征

2．5 本章小结

第三章 固定化金属磁性亲和介质的制备及吸附研究

3．1 引言

3．2 试剂与仪器

3．2．1 原料与试剂

3．2．2 仪器设备

3．3 实验方法

3．3．1 固相载体的活化

3．3．2 磁性亲和介质的制备

3．3．3 磁性亲和介质对BSA的吸附

3．3．4 分析方法

3．4 结果与讨论

3．4．1 磁性壳聚糖微球的活化工艺研究

3．4．2 铜离子的标准曲线

3．4．3 固定化Cu2+亲和介质吸附BSA的工艺考察

3．4．4 吸附动力学模型初步研究

3．5 本章小结

第四章 二醇基修饰磁性固定化Cu2+亲和介质的研究

4．1 引言

4．2 试剂与仪器

4．2．1 原料与试剂

4．2．2 仪器设备

4．3 实验方法

4．3．3 M-CS@Cu2+@OH微球的制备和吸附

4．3．4 分析方法

4．4 结果与讨论

4．4．1 VSLPEW的标准曲线

4．4．2 M-CS@OH、M-CS、M-CS@Cu2+对VSLPEW和BSA的吸附比较

4．4．3 M-CS@Cu2+@OH微球的制备和吸附

4．5 本章小结

第五章 M-CS@Cu2+@OH在混合体系的吸附选择性研究

5．1 引言

5．2 材料与设备

5．2．1 原料与试剂

5．2．2 仪器设备

5．3 实验方法

5．3．1 介质在混合体系中的吸附比较

5．3．2 洗脱条件和介质重复使用及再生情况的考察

5．3．3 介质在实际体系中的吸附比较

5．3．4 分析方法

5．4 结果与讨论

5．4．1 介质在混合体系中的吸附比较

5．4．2 洗脱条件和介质重复使用及再生情况的考察

5．4．3 介质在实际体系中的吸附比较

5．5 本章小结

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表学术论文情况