狂犬病病毒M蛋白与转录相关的功能性位点鉴定

摘要

狂犬病病毒可引起中枢神经系统发生病变，造成全球每年死亡人数高达70，000人，死亡率极高。目前没有特效药治疗狂犬病，只能通过接种疫苗来预防狂犬病病毒的感染。　　狂犬病病毒是单股负链不分节段的的RNA病毒，编码N、P、M、G和L五个结构蛋白，病毒RNA与N、P、L蛋白紧密结合在一起共同组成病毒的核糖核蛋白复合物(RNP)，是病毒转录和复制的活性中心。　　本研究以广西街毒株GX01株为研究对象，以固定弱毒株RC-HL为模板，研究GX01株M基因的生物学特性。在此前的研究中，我们发现GX01株M蛋白可以抑制病毒的转录和复制，并找到引起这种抑制作用的关键位点是M44和M46，当对RC-HL的M蛋白进行F44L或F44L/S46G联合突变时，可显著抑制病毒的转录及在细胞间的传播性，但S46G的变异可增强病毒的转录过程。　　为阐述产生这种现象的机制，本实验以rRC-HL(GX01M)为模板，将GX01株M蛋白44、46位氨基酸突变成RC-HL株相应位点的氨基酸，得到重组病毒rRC-HLM(L44F)、rRC-HLM(G46S)和rRC-HLM(L44F/G46S)株，对其进行生物学特性鉴定，检测病毒的多步生长曲线、蛋白表达量以及mRNA水平，发现rRC-HLM(L44F)株的转录和M蛋白表达水平与亲本株rRC-HL相近，病毒的生长繁殖得到恢复;但拯救的rRC-HLM(G46S)株的转录和M蛋白表达水平稍低于rRC-HL(GX01M)株，说明G46S突变可轻微抑制病毒的复制和转录;双突变株rRC-HLM(L44F/G46S)的转录和M蛋白表达水平稍高于rRC-HL(GX01M)株，病毒的生长繁殖有所提高，这与之前本实验小组得出的结论相符，结果可信。　　rRC-HL(F44L/S46G)株可显著下调病毒的复制和转录水平，影响病毒的生长，推测与S46潜在磷酸化位点有关，所以构建并拯救去磷酸化突变株rRC-HL(F44L/S46A)，模拟磷酸化的突变株rRC-HL(F44L/S46D)和rRC-HL(F44L/S46E)，同样检测拯救的突变病毒的生物学特性，发现突变病毒rRC-HL(F44L/S46D)和rRC-HL(F44LS46E)株的病毒转录能力和M蛋白表达量与亲本株rRC-HL无异，而rRC-HL(F44L/S46A)株在病毒感染的早期，转录水平与rRC-HL(GX01M)株相近，后期病毒生长繁殖能力提高，接近亲本株rRC-HL的水平，并没有出现与rRC-HL(F44L/S46G)株一样的显著下调病毒转录的现象，说明46位点的丝氨酸不是磷酸化位点。　　我们用拯救得到的所有毒株感染BSR/T7-9细胞，检测RIG-Ⅰ信号通路蛋白，发现狂犬病病毒M蛋白的表达量与TBK1表达水平之间存在负相关关系，随着狂犬病病毒M蛋白量的增加TBK1的表达量下调，反之亦然，从而抵抗细胞产生抗病毒免疫反应。　　用ELISA方法检测感染狂犬病病毒的细胞产生TNF-α、 IL-1β、IFN-γ、IL-6和IL-12的情况。发现狂犬病病毒感染BSR/T7-9细胞之后，TNF-α和IL-1β水平没有明显上升。在病毒感染的早期，IL-12的表达量最高，发挥主要的抗病毒作用，而后期，IFN-γ、 IL-6和IL-12的表达都增多，在抵抗病毒入侵的过程中，三者都起到一定的抵抗作用。

目录

声明

摘要

中英文缩写对照表

第一章 文献综述

1．1 狂犬病病毒概述

1．1．1 狂犬病的感染途径及过程

1．1．2 狂犬病病毒的结构

1．1．3 狂犬病病毒的复制和转录

1．2 狂犬病病毒M基因的作用

1．2．1 M蛋白与病毒出芽

1．2．2 M蛋白与致病性的关系

1．3 狂犬病病毒与干扰素的研究

1．4 狂犬病病毒与细胞因子

1．5 狂犬病病毒与反向遗传研究技术的关系

1．5．1 反向遗传学技术在狂犬病病毒研究中的发展

1．5．2 反向遗传学技术在狂犬病病毒研究中的应用

1．6 开展本研究的目的和意义

2．1．1 细胞、病毒和质粒

2．1．2 主要实验仪器

2．1．3 主要实验试剂

2．1．4 抗体和ELISA试剂盒

2．1．5 引物的设计合成

2．2 方法

2．2．1 构建狂犬病突变病毒感染性cDNA克隆

2．2．2 拯救狂犬病重组突变病毒

2．2．3 IFA试验初步鉴定拯救的突变病毒

2．2．4 重组突变病毒M基因的序列检测

2．2．5 制备种毒并测定毒价

2．2．6 测定病毒的多步生长曲线

2．2．7 蛋白免疫印迹实验(Western Blot)

2．2．8 实时荧光定量PCR(qPCR)试验

第三章 实验结果

3．1．狂犬病病毒M蛋白与转录相关的功能位点鉴定

3．1．1 构建突变病毒感染性cDNA克隆

3．1．2 拯救重组突变病毒

3．1．3 重组病毒M基因突变位点的鉴定

3．1．4 突变病毒的多步生长曲线

3．1．5 突变病毒蛋白的水平变化

3．1．6 vRNA水平和N、M基因的转录水平

3．2 狂犬病病毒M蛋白潜在磷酸化位点的鉴定

3．2．1 构建突变病毒感染性cDNA克隆

3．2．2 拯救重组突变病毒

3．2．3 重组病毒M基因突变位点的鉴定

3．2．4 突变病毒的多步生长曲线

3．2．5 突变病毒的M蛋白水平变化

3．2．6 vRNA水平和N和M基因的转录水平

3．3 狂犬病病毒M蛋白功能位点与免疫通路关联性的初步探索

3．3．1 狂犬病病毒感染BSR／T7-9细胞与RIG-I信号通路的关系

3．3．2 BSR／T7-9细胞感染狂犬病病毒后TNF-α、IL-1β的产生情况

3．3．3 BSR／T7-9细胞感染狂犬病病毒后IFN-γ、IL-6和IL-12的产生情况

第四章 讨论

4．1 狂犬病病毒M蛋白与转录相关的功能位点鉴定

4．2 狂犬病病毒M蛋白潜在磷酸化位点的鉴定

4．3 狂犬病病毒M蛋白功能位点与免疫通路关联性的初步探索

第五章 结论

参考文献

致谢