补肺消积饮对人肺腺癌细胞株A549细胞增殖、凋亡及MGMT基因甲基化影响的研究

摘要

目的:本实验通过观察补肺消积饮对肺癌细胞株A549的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡作用，确定补肺消积饮的最适浓度和最适时间;研究补肺消积饮对A549细胞MGMT基因甲基化的影响，尝试阐述抑制该细胞增殖、诱导细胞凋亡的机制，为中医药治疗肿瘤提供理论基础和实验依据。　　 方法:1、培养A549细胞，每2～3天传代一次，选取对数生长期细胞进行实验。2、MTT法探索补肺消积饮抑制A549细胞生长活性的浓度和作用时间:细胞加入补肺消积饮培养液，设置800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/L共9个浓度梯度，另设立阴性对照组不加药物，每组4个复孔。继续培养。分别于24、48、72小时，以MTT法测定补肺消积饮对A549细胞生长活性的影响。3、AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法检测细胞凋亡:各组细胞加药48h经处理后于流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡。获得细胞凋亡数据后用ModFitLT软件进行细胞凋亡相对定量分析。4、RT-PCR法检测MGMT基因表达:分别取经过补肺消积饮各时相干预的细胞，提取出各时相细胞的mRNA，通过逆转录技术，合成各时相细胞cDNA，通过设计的人MGMT基因的引物，PCR扩增出MGMT基因序列，并以GAPDH基因做内参，运用软件检测出各时相干预的细胞MGMT基因的表达量。5、统计学分析SPSS18.0软件分析，数据以均数士标准差表示，计量资料采用(x)±s表示，多组资料采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有显著统计学意义，P＞0.05表示差异无统计学意义。　　 结果:1、补肺消积饮抑制肺癌细胞株A549细胞的增殖，呈时间剂量依赖性。25mg/L补肺消积饮处理A549细胞48h后，A549细胞的生长增殖出现明显的抑制作用。　　 2、AnnexinⅤ/PI法证实了补肺消积饮可以诱导人肺癌细胞株A549凋亡。　　 3、RT-PCR结果显示补肺消积饮可降低MGMT甲基化水平，并与一定浓度内补肺消积饮的作用浓度和时间相关。　　 结论:1、补肺消积饮能够抑制肺癌细胞的生长，阻止肺癌细胞恶性增殖。2、补肺消积饮通过诱导肺癌细胞凋亡，提高细胞凋亡率，从而发挥抑制肿瘤发生发展的作用。3、补肺消积饮诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的机制可能是通过降低MGMT甲基化水平从而影响其他凋亡相关因子的表达或相关途径的传导中断而实现的。

目录

中英文缩略词汇表

摘要

引言

第一部分 材料与方法

1 材料

1．1 细胞

1．2 药物及试剂

1．3 实验仪器及耗材

2 方法

2．1 主要溶液配制

2．2 细胞培养

2．3 MTT检测补肺消积饮对A549细胞增殖活性的影响

2．4 Annexin V／PI流式细胞分析法检测细胞凋亡

2．5 RT-PCR检测各组细胞中目的基因的表达

2．6 密度分析

2．7 数据的统计学处理

第二部分 结果与分析

1 补肺消积饮对A549细胞增殖的影响

1．1 补肺消积饮处理A549细胞后MTT法检测结果

1．2 补肺消积饮作用后A549细胞形态学变化

2．补肺消积饮对细胞凋亡的影响

3．补肺消积饮对A549细胞中MGMT基因甲基化的影响

第三部分 讨论

1 现代医学对非小细胞肺癌的认识

1．1 病因及发病机制

1．2 病理和分类

1．4 非小细胞肺癌的治疗现状

2 祖国医学对非小细胞肺癌的认识

2．1 历史源流

2．2 古代医家对肺癌病因病机的认识

2．3 现代医家对肺癌病因病机的认识

2．4 导师对非小细胞肺癌的认识

3 中医药治疗NSCLC的优势

3．1 中医药联合手术治疗非小细胞肺癌

3．2 中医药联合放疗治疗非小细胞肺癌

3．3 中医药联合化疗治疗非小细胞肺癌

3．4 中医药治疗非小细胞肺癌

4 细胞凋亡

4．1 概述及其意义

4．2 中医药诱导肺癌细胞凋亡的研究进展

5 MGMT

5．1 MGMT启动子高甲基化与NSCLC的关系探讨

5．2 MGMT启动子高甲基化影响肿瘤发生发展的机理探讨

6 补肺消积饮

6．1 主方意义

6．2 补肺消积饮的临床疗效

6．3 方中单味中药药理作用研究

6．4 补肺消积饮对人非小细胞肺癌A549细胞机理的影响

7 存在问题和展望

结论

参考文献

综述 CMGMT对肿瘤的作用机制及其影响因素

致谢

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