革巴向干扰ghrelin基因对急性膜腺炎膜腺腺泡细胞炎症与钙通路的调节机制研究

摘要

实践及研究表明，急性胰腺炎( acute pancreatitis，AP)的发病机制是一个复杂的、多因素参与的病理生理过程，其发病机制至今尚未完全阐明。新近提出的“炎症介质或细胞因子学说”和“钙超载学说”是近年关注的热点，在这些学说中有何种机制发挥重要作用呢？本课题组的前期动物实验表明ghrelin在大鼠AP胰腺组织中表达增高，且其表达水平随着AP病情程度的加重而增加【1】。既往已有动物实验研究证实外源性给予ghrelin可以减少AP炎症介质和炎症因子的释放，也可以引起胰腺腺泡细胞内钙离子增高。由于ghrelin的广泛分布及其所具有的多种生物学功能，我们推测内源性ghrelin在AP的发生发展中可能发挥了重要作用，而其作用机理是否与此类似？本文拟对此展开研究。　　第一部分 体外急性胰腺炎胰腺腺泡细胞模型构建及细胞模型内ghrelin的表达　　目的：　　应用雨蛙肽或脂多糖诱导大鼠AR42J胰腺腺泡细胞，以构建体外AP胰腺腺泡细胞模型；研究ghrelin在正常AR42J细胞以及在雨蛙肽诱导AR42J细胞构建的AP胰腺腺泡细胞模型内的表达情况。　　方法：　　应用不同浓度雨蛙肽(0，10-8，l0-7，10-6mol/L)或脂多糖(0，1，10， 100mg/L)刺激大鼠AR42J细胞24h，采用底物酶法测定细胞上清液淀粉酶含量，RT-PCR方法测定细胞内核转录因子B(nuclear factor kappaB，NF-ΚB) p65、磷酸化IκB-α、L型钙通道(L-type calcium channel，Cav1.2，Cav1.3)、P/Q型钙通道(P/Q-type calcium channel，Cav2.1)、N型钙通道（N-type calcium channel，Cav2.2）、T型钙通道(T-type calciumchannel，Cav3.1，Cav3.2)、ghrelin mRNA表达水平，Western Blot方法测定细胞内NF-ΚB p65、磷酸化IκB-α、Cav1.2、Cav1.3、ghrelin蛋白表达水平，Elisa方法测定细胞培养上清液白介素(interleukin，IL) -1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)蛋白表达水平，Fluo-4-am钙离子荧光探针联合激光共聚焦扫描显微镜测定细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)。　　结果：　　1．不同浓度雨蛙肽或脂多糖干预AR42J细胞24 h后，细胞培养液上清中淀粉酶含量与对照组相比无显著差异(P＞0.05)。　　2．与对照组相比，不同浓度雨蛙肽作用24小时后，AR42J细胞NF-ΚB p65、IκB-α、Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav3.1、Cav3.2 mRNA (F=9.259, 15.370, 19.189, 14.735,42.459, 23.000, 16.63, P＜0.05)及NF-ΚB p65、IκB-α、Cav1.2、Cav1.3蛋白表达水平（F=7.325，11.341，7.862，42.616，P＜0.05）均明显增高；部分因子组内比较(NF-ΚB p65、Cav1.3、Cav2.1、Cav3.2mRNA及NF-ΚB p65、IκB-α、Cav1.2、Cav1.3)呈剂量依赖性增高（P＜0.05），Cav2.2mRNA表达无明显变化( F=2.121，P=0.138 ＞0.05);不同浓度脂多糖作用24小时后的AR42J细胞上述基因mRNA表达水平均无明显变化(F=0.552，0.174，0.491，0.182，0.185，0.509，0.125，0.350，P＞0.05)。　　3．不同浓度雨蛙肽作用24小时后，AR42J细胞培养上清液中IL-1β、IL-6蛋白表达水平较对照组均明显增高，并呈剂量依赖性(F=102.185，349.787，P＜0.05)；不同浓度脂多糖对上述炎症因子蛋白表达无显著影响( F=1.720，0.514; p=0.203，0.679＞0.05); Elisa检测各组AR42J细胞TNF-α的OD值过低，无法计算出相应的蛋白浓度。　　4．不同浓度雨蛙肽作用24小时后，AR42J细胞内[Ca2+]i较对照组均显著增高，且不同浓度雨蛙肽组间[Ca2+]i比较呈剂量依赖性增高(F=421.939，P＜0.05)。　　5．雨蛙肽处理组AR42J细胞ghrelin mRNA和蛋白表达水平较对照组明显升高（F=45.128，67.2358，P＜0.05），并呈剂量依赖性(P＜0.05)。　　结论：　　1．雨蛙肽和脂多糖刺激AR42J细胞前后，细胞培养上清液淀粉酶无明显变化；　　2．雨蛙肽刺激能引起AR42J细胞多种炎症因子和钙通道基因mRNA、蛋白表达水平以及[Ca2+]i升高，提示AP胰腺腺泡细胞模型构建成功；　　3．脂多糖刺激对AR42J细胞多种炎症介质和钙通道基因mRNA及蛋白表达无显著影响；　　4．ghrelin在大鼠胰腺腺泡细胞AR42J中存在高表达，雨蛙肽刺激AR42J细胞后ghrelin mRNA和蛋白表达水平较对照组升高。　　第二部分 ghrelin miRNA慢病毒干扰载体的构建、筛选及对AR42J细胞的靶向干扰效果　　目的：　　筛选有效的大鼠ghrelin miRNA序列，构建ghrelin miRNA慢病毒载体；应用构建的慢病毒ghrelin miRNA载体转染AR42J细胞，观察其对细胞内ghrelin基因表达的抑制情况。　　方法：　　1．针对ghrelin基因构建四个干扰质粒：pcDNATM6.2-X207-1-3，pcDNATM6.2- X207-2-1,pcDNATM6.2- X207-3-1, pcDNATM6.2- X207-4-1;构建高表达载体pCDNA3.1(+);干扰载体和高表达载体共转染HEK293细胞，qPCR检测目的基因的表达情况，筛选出最佳干扰载体X207-1-3；使用BP重组系统和LR重组系统将目的片段从miRNA载体重组到慢病毒载体pLenti6.3/v5 DEST上，筛选阳性克隆并测序验证；用构建的慢病毒表达载体pLenti6.3- X207-1和包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，收集病毒原液，超速离心浓缩，并测定滴度。　　2．将AR42J细胞分为5组：空白对照组、阴性对照组(MOI=100)、ghrelin-miRNAA组(M0I=50)、ghrelin-miRNAB组(M0I=80)、ghrelin-miRNA C组(MOI=100);应用RT-PCR和Westem Blot方法分别检测各组细胞内ghrelin mRNA和蛋白的表达水平。　　结果：　　1．qPCR检测4个miRNA序列对ghrelin基因的沉默效应，其中以pcDNATM6.2- X207-1-3下调最为明显(86%)。　　2．选择沉默效应最明显(86%)的序列包装慢病毒，病毒滴度为1x108TU/ml。3．ghrelin miRNA能被重组慢病毒高效地转染入AR42J细胞，转染效率高达80%，RT-PCR和Westem Blot结果显示靶基因慢病毒转染C组(MOI=100)细胞内ghrelinmRNA和蛋白表达的干扰效果最明显（P＜0.05）。　　结论：成功构建慢病毒ghrelin miRNA载体，并包装出高滴度病毒，为后续实验奠定基础；构建的慢病毒ghrelin miRNA载体可以有效沉默AR42J细胞内的ghrelin基因。　　第三部分 靶向干扰ghrelin基因对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞炎症通路及钙通路的影响　　目的：　　研究靶向抑制ghrelin表达对雨蛙肽刺激AR42J细胞构建的AP胰腺腺泡细胞模型内炎症通路及钙通路的变化。　　方法：　　1．将AR42J细胞分为4组：空白对照组、雨蛙肽组、阴性对照+雨蛙肽组、ghrelin-miRNA+雨蛙肽组。　　2．应用RT-PCR和Westem Blot方法分别检测各组细胞内NF-1κB p65、磷酸化IκB-α、Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1 mRNA及蛋白的表达，Elisa方法检测各组细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的表达。　　3．Calcium CrimsonTM，AM钙离子荧光探针标记联合激光共聚焦扫描显微镜测定各组[Ca2+]i。　　结果：　　与雨蛙肽组和阴性对照+雨蛙肽组相比，ghrelin-miRNA+雨蛙肽组AR42J细胞；NF-κB p65、磷酸化IκB-αmRNA表达水平(F=51.255，9.266;P＜0.05）和蛋白表达水平显著升高(F=7.533，18.876; P＜0.05)，细胞上清液IL-1β、IL-6蛋白表达水平显著升高(F=334.554，336.462; P＜0.05)；Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1 mRNA表达水平(F=37.208，55.651，42.640;P＜0.05)及Cav1.2、Cav1.3蛋白表达水平明显降低(F=6.894，64.239; P＜0.05); [Ca2+]i明显降低(F =61.358，P＜0.05)。　　结论：　　靶向抑制AP胰腺腺泡细胞内ghrelin基因的表达，一方面可以上调细胞内炎症因子的表达，另一方面可以减轻其细胞内钙超载。　　第四部分 全基因组基因芯片分析靶向干扰ghrelin基因对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞基因表达谱特征的影响　　目的：　　筛选靶向抑制ghrelin表达的AP胰腺腺泡细胞内基因表达差异，并进一步分析相关信号通路，以探讨其分子生物学机制。　　方法：　　1．将AR42J细胞分为2组：ghrelin-miRNA+雨蛙肽组、阴性对照+雨蛙肽组。　　2．实验干预后收集细胞提取RNA，并进行RNA质量鉴定。将总RNA合成为ds-DNA后进行标记，并与NimbleGen大鼠全基因组基因芯片杂交，运用Axon GenePix 4000B基因芯片扫描仪进行扫描。　　3．所有基因水平文件输入Agilent GeneSpring GX 11.5.1软件进行聚类分级，进一步进行GO分析和通路分析。　　结果：　　1．NimbleGen全基因组基因芯片筛选出ghrelin基因沉默及雨蛙肽诱导的AR42J细胞差异表达基因上调或下调2倍以上基因共2938个，其中表达上调基因1435个，表达下调基因1503个。　　2.GO分析结果显示差异表达基因在biological process分类中，与各种代谢过程相关的基因出现最多，其次为生物调节、进化过程、细胞过程调节等；在cellular component分类中，改变最为显著的差异表达基因主要位于细胞及细胞内部分、细胞核、膜型细胞器等细胞成分中；在molecular function分类中，与结合相关的基因差异最多，包括蛋白结合、金属离子结合、阳离子结合、核苷酸结合、小分子结合等。　　3．Pathway分析结果显示表达上调基因涉及31个信号通路，表达下调基因涉及30个信号通路。　　4．通过筛查与炎症和钙通路相关的差异表达基因，结果显示，与CAMP/Ca2+信号通路相关的差异表达基因有60个，与炎症通路相关的差异表达基因有199个。　　结论：　　通过芯片结果、Pathway及GO分析等初步筛查发现：ghrelin对AP胰腺腺泡细胞的作用机制可能与细胞内代谢过程及离子、蛋白等结合功能有关；相关通路可能包括MAPK信号通路、细胞间粘附分子信号通路、焦点连接、Wnt信号通路、P53信号通路等。

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