脑脉泰对大鼠脑缺血再灌注炎症级联反应变化的影响

摘要

目的：运用免疫组化法和原位杂交法检测大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注(MCA-CI/RP)模型脑组织中炎症因子，即肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间粘附分子—1mRNA（ICAM—1mRNA）的表达变化。并对 MCA－CI/RP大鼠进行神经功能障碍评分、脑梗死体积测算，探讨神经保护作用及其机制。并进一步探索脑脉泰对炎症因子表达变化的影响，丰富其在缺血性脑血管疾病治疗的理论基础，为临床用药提供理论依据。　　方法：参考 Longa线栓法并加以改良建立大鼠 MCA－CI/RP动物模型。将130只清洁级健康成年雄性SD大鼠按随机数字表随机分成4组，假手术组(Sham group，Ⅰ)、模型组(Model group，Ⅱ)、尼莫地平组(Nimodipine group，Ⅲ)、脑脉泰组(Naomaitai group，Ⅳ)，其中Ⅰ组为10只，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组各40只，并将Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组按缺血3小时（I3h），缺血再灌注1天(I/R1d)、缺血再灌注3天(I/R3d)、缺血再灌注6天（I/R6d）四个时间点再各自分成a、b、c、d四小组，每小组各10只。造模前5d开始灌胃给药，造模前2h加灌1次，假手术组和模型组灌生理盐水。各组于断头取脑前参考Zea Longa的5分制评分标准进行神经功能障碍评分，应用TTC染色法测定脑梗死体积，免疫组化法检测 TNF-α的表达，全自动彩色图像处理系统进行图像分析，测定阳性反应的灰度值，计算出平均值，以表示表达的相对强度。灰度值与物质表达呈反向关系，即灰度值越高，免疫组化染色越浅，表达越低。ICAM—1mRNA采用原位杂交方法测定。所得数据使用SPSS13.0统计学软件包进行统计学处理，数据均以x±s表示。　　结果：脑梗死体积测算：大鼠 MCA－CI/RP后，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各组均出现不同程度的白色梗死灶，主要位于额顶叶皮层、海马区、尾状核、苍白球、内囊后肢、部分下丘脑和丘脑等，与 MCA支配的脑区域一致。以缺血3h时点梗死体积最大，随再灌注时间延长梗死体积逐渐减小。Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc、Ⅲd、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd各组梗死体积率（％）分别为29.65〒4.13、27.2〒3.76、26.2〒3.11、27.8〒3.41、18.42〒3.78、17.0〒3.37、14.2〒3.11、13.51〒3.57、13.37〒3.21、12.41〒2.81、9.95〒3.46、7.85〒2.97，Ⅲ、Ⅳ各组与Ⅱ组相比较，均能显著缩小缺血再灌注后脑组织梗死体积，差异有统计学意义（P<0.05）。其中Ⅳ组各时点梗死体积较Ⅲ组各时点梗死体积小，差异有统计学意义（P<0.05）。　　神经功能障碍评分：假手术组大鼠未见神经功能障碍，其余各组大鼠于造模后12h均出现神经功能缺失症状，在再灌注后第3d最重，随再灌注时间延长逐渐减轻。各组Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc、Ⅲd、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd Longa评分（分）分别为3.97〒0.22、3.87〒0.23、3.80〒0.30、3.79〒0.30、3.35〒0.53、3.15〒0.47、3.10〒0.33、3.03〒0.43、2.50〒0.32、2.45〒0.37、2.13〒0.52、2.01〒0.47，与Ⅱ组比较，Ⅲ、Ⅳ组各时点症状稍轻，评分均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。其中Ⅳ组较Ⅲ组神经功能改善较明显，差异有统计学意义（P<0.05）。　　TNF-α表达变化：MCA－CI/RP后，各组大鼠缺血侧的脑组织可见不同程度的TNF-α表达，主要分布区域为梗死病灶的周边区，于CI/RP1d达到高峰，随着缺血再灌注时间的延长程下降趋势。各组Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc、Ⅲd、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd TNF-α阳性反应（灰度值）分别为143.71〒8.08、134.23〒4.98、136.83〒6.58、144.58〒9.26、165.40〒6.96、160.72〒9.41、166.30〒5.37、165.68〒9.11、189.30〒7.32、186.67〒5.69、184.09〒5.01、186.71〒6.72，Ⅰ组大鼠脑组织内仅有微量的TNF-α表达，灰度值较高。与Ⅱ组比较，Ⅲ、Ⅳ各组阳性反应灰度值出现不同程度升高，差异有统计学意义（P<0.05）。Ⅲ组与Ⅳ组比较，Ⅳ组各时点较Ⅲ组各时点阳性反应灰度值高，差异有统计学意义（P<0.05）。　　ICAM—1mRNA表达变化：MCA－CI/RP后，各组均可见不同程度阳性细胞表达，于I/R1d达到高峰，随着缺血再灌注时间的延长程下降趋势。其阳性细胞表达数（个）分别为20.83〒1.33、33.17〒3.87、26.33〒2.13、17.33〒1.90、14.33〒2.88、28.00〒1.28、22.83〒2.33、13.00〒1.20、13.67〒1.37、23.17〒3.19、16.00〒2.10、11.83〒2.70，Ⅰ组鼠脑内仅有微弱的ICAM—1mRNA表达。与Ⅱ组比较，Ⅲ、Ⅳ各组阳性反应细胞数较少，差异有统计学意义（P<0.05）。Ⅲ组与Ⅳ组比较，Ⅳ组各时点较Ⅲ组各时点阳性反应细胞数少，差异有统计学意义（P<0.05）。　　结论：1.采用线栓法成功复制出大鼠MCA－CI/RP模型，缺血后大鼠出现 TTC染色阳性梗死脑组织增加、神经功能缺损加重，缺血再灌注后 TNF-α、ICAM—1mRNA表达增强。2.脑脉泰可以缩小MCA-CI/RP大鼠脑梗死体积以及梗死后神经功能缺损程度。3.脑脉泰的神经保护作用是通过降低TNF-α、ICAM—1mRNA表达实现的。综上，脑脉泰可合理有效调解 TNF-α、ICAM—1mRNA表达、抑制炎症级联反应，成为其治疗缺血性再灌注损伤的内在机制。

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引言

正文

1.实验材料和方法

1.1实验对象、试剂、仪器和药品

1.2 实验方法：

2.实验结果

2.1 大鼠脑缺血再灌注后神经行为改变及神经功能缺失评分

2.2 TTC染色结果(详见表2、图3)

2.3 免疫组化法检测脑脉泰对 TNF-α表达水平的影响

2.4原位杂交法检测脑脉泰对ICAM-1mRNA表达水平的影响

3.讨论

3.1 缺血性脑卒中的中医病因病机及治则

3.2脑缺血再灌注模型的选择及神经功能、梗死体积的讨论

3.3关于脑缺血再灌注损伤后TNF-α阳性表达的讨论

3.4关于脑缺血再灌注损伤后ICAM-1阳性表达的讨论

4.存在的问题和展望

结论

参考文献

附录

附图

综述

致谢

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